改良快速骨組織脫鈣法在透射電鏡樣品制備中的應用

王立言，邴馨，劉尚明*，王輝，陳艷雯

（山東大學基礎醫(yī)學院實驗核醫(yī)學與電鏡中心，濟南 250012）

脫鈣是制備骨組織透射電鏡樣品的第一步。然而，如何縮短脫鈣時間，把握脫鈣終點，減少脫鈣過程中對組織的損傷，盡可能保持骨組織原有的微細結構，一直是研究人員密切關注的問題。傳統(tǒng)的脫鈣方法一般采用復合酸類脫鈣液，其效果不穩(wěn)定，對細胞及組織結構的破壞及對染色的影響，已不能滿足透射電鏡觀察的要求[1,2]；EDTA脫鈣的作用優(yōu)于酸性脫鈣液，但脫鈣周期長，一般需要2-4周，不利于科研實驗的進展。本方法通過大量實驗，采用JYBL-Ⅱ組織脫鈣液并在此基礎上進行了改進，對骨組織脫鈣后進行透射電鏡樣品制備，在電鏡下觀察取得良好效果，同時很大程度的降低了脫鈣時間。

材料與方法

1 標本

取小鼠新鮮股骨組織，大小為1 mm×1 mm×3 mm。

2 試劑

改進的脫鈣液為Leagene JYBL脫鈣液、戊二醛及磷酸緩沖液按一定比例配制而成的混合液。具體配制方法如下：100 mL Leagene JYBL-Ⅱ脫鈣液（北京雷根生物技術有限公司）、20 mL 25%戊二醛（SPI，美國）、40 ml 0.2 mol/L，pH7.4 磷酸緩沖液混合均勻，4℃冰箱保存。

3 實驗方法

傳統(tǒng)脫鈣方法：將取好的骨組織入預冷的3%戊二醛中，4℃下固定2~4 h或更長。骨組織固定好后入緩沖、等滲、中性EDTA脫鈣液中，4 ℃下振蕩脫鈣2~4周。

改良脫鈣方法：將取好的骨組織立刻投入到3%戊二醛與4%多聚甲醛的混合液中，4 ℃固定12 h；0.1 mol/L、pH7.4磷酸緩沖液浸洗1 h（0~4℃）；棄去緩沖液，在小瓶中加入改進脫鈣液對骨組織進行脫鈣（4 ℃）。脫鈣液要沒過骨組織，約為骨組織體積的40倍；脫鈣時間控制在24 h以內：每隔一段時間檢測一次脫鈣程度，在骨組織富有彈性、針刺無阻力感時即可終止脫鈣。在保證超薄切片質量情況下，應盡量縮短脫鈣時間，避免脫鈣時間過長和反復針刺檢測造成組織損傷。

兩種方法脫鈣結束后，均行常規(guī)透射電鏡樣品制備過程：0.1 mol/L、pH7.4磷酸緩沖液浸洗3 h，中間換液3次（0～4℃）；1%鋨酸中后固定2 h（0～4℃）；0.1 mol/L、pH7.4磷酸緩沖液浸洗3 h，中間換液3次；依次在30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮中梯度脫水，每次15 min，其中100%丙酮脫水2次；在純丙酮∶Epon 812包埋劑為3∶1、1∶1和1∶3的混合浸透液中分別浸透1 h、3 h和12 h后，在純包埋劑中浸透12 h；用純包埋劑再包埋模具中包埋；37 ℃和45 ℃各聚合2 h后，60 ℃聚合48 h；超薄切片機（劍橋，英國）切片、醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后行透射電鏡（JEM-1200EX，日本電子）觀察[3]。

結 果

透射電鏡觀察顯示：用傳統(tǒng)方法脫鈣處理的樣品其切片質量較差，骨細胞突起減少，膠原纖維、細胞核及細胞器均不清晰，骨細胞超微結構破壞較明顯（圖1A）；而用改良脫鈣方法處理的樣品其切片質量更好，超微結構更完整，骨陷窩內骨細胞清晰可見，骨細胞表面的突起保存完好，細胞核及胞質內的細胞器結構完整清晰，基質中的膠原原纖維在縱切面上可見明顯的周期性橫紋（圖1B）。

討 論

骨組織由細胞、纖維和基質構成，其中含有大量的無機鹽。無機鹽的主要成分為以羥基磷灰石結晶形式存在的磷酸鈣和碳酸鈣[4]，約占骨干重的70%。由于鈣鹽的沉積，骨組織非常堅硬。在透射電鏡樣品制備過程中，如果不去除骨組織的鈣質，會給固定、脫水、浸透帶來困難，也無法制作出有效的超薄切片。因此在樣品制備前需要對骨組織進行有效脫鈣，使鈣鹽溶解，使標本變軟[5]，才能進行后續(xù)操作。

目前的脫鈣液有有機酸、無機酸、乙二胺四乙酸(EDTA)等多種。用酸類脫鈣時，脫鈣速度快，但對骨組織破壞明顯，因此不適合透射電鏡樣品的制備。EDTA是一種相對較好的螯合脫鈣劑，對組織結構影響較小，能保存組織中的抗原物質和某些酶的活性，但是EDTA 脫鈣操作復雜，脫鈣時間長（2~4周）。長時間的脫鈣不利于脂類等物質的保存，也延長了實驗周期[6-8]。經過大量的實踐，我們改進了JYBL-Ⅱ組織脫鈣液，在脫鈣液中加入專用的戊二醛電鏡固定劑，同時對戊二醛的濃度、滲透壓、pH值等參數進行了精確調整，消除試劑間的相互作用，由此更適合于制備電鏡樣品[9]。該方法的特點是：①作用迅速，24 h即可完成脫鈣；②固定和脫鈣同時進行，更利于微細結構的保存。③脫鈣完全。如果脫鈣不完全，膠原原纖維上的無機鹽結晶會使周期性橫紋不可見。

本研究結果表明，應用后改良快速骨組織脫鈣法制備透射電鏡樣品，可有效防止骨組織過度膨脹和脫鈣對骨組織的損傷，脫鈣時間由傳統(tǒng)的2~4周縮短至24 h；骨組織超微結構保持完好，細胞及纖維形態(tài)結構清晰；脫鈣液中的戊二醛可以較好的保存抗原活性[10]，脫鈣后的骨組織可正常進行免疫組織化學和原位雜交組織化學染色；脫鈣過程中無需更換脫鈣液，操作簡便，脫鈣均勻，效果良好，在骨組織透射電鏡樣品制備中具有較高的應用價值。