自噬與皮瓣缺血再灌注損傷

張團(tuán)莊，宋淵*，劉濤，姚興璋

（1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州730030；2甘肅省中醫(yī)院，蘭州730050）

隨著科技的進(jìn)步和社會(huì)的發(fā)展，工業(yè)、農(nóng)業(yè)和交通運(yùn)輸業(yè)也緊跟社會(huì)步伐，開(kāi)放性損傷也逐漸見(jiàn)增多，這類損傷處理棘手。在臨床上，解決組織缺損，目前最有效的手段就是皮瓣移植[1,2]，但是在皮瓣移植的過(guò)程中，皮瓣會(huì)因?yàn)槿毖詨乃馈６岣咂ぐ甑某苫盥蕜t是改善皮瓣的血液循環(huán)，降低缺血再灌注損傷。皮瓣缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion，I/R）是指皮瓣在較長(zhǎng)時(shí)間缺血的情況下重獲血液灌流或氧供后反而損傷加重的現(xiàn)象[3]。雖然皮瓣設(shè)計(jì)和手術(shù)技術(shù)都有了改進(jìn)，但其長(zhǎng)寬比仍不能超過(guò)1.5~2:1，限制了[4]的臨床應(yīng)用。目前I/R損傷的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，既往研究發(fā)現(xiàn)血供不足、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致皮瓣壞死的3個(gè)重要因素[5]。近年來(lái)，對(duì)于I/R損傷防治的研究越來(lái)越多，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞是皮瓣I/R損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一[6]，缺血后的處理與血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)有關(guān)。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)I/R損傷中自噬對(duì)于皮瓣防治有一定的關(guān)系[7]。氧化應(yīng)激和自噬凋亡是I/R的2個(gè)主要機(jī)制[8]，是導(dǎo)致隨意皮瓣壞死的關(guān)鍵因素。激活自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要手段，可以提高皮瓣的存活率。越來(lái)越多的研究表明，缺血甚至壞死是由于氧化應(yīng)激和血供[7]不足所致。因此，抑制氧化應(yīng)激和加速血管生成是促進(jìn)隨機(jī)模式皮瓣存活的主要策略。而目前在甘肅省中醫(yī)院受醫(yī)生和患者認(rèn)可的，是由甘肅省中醫(yī)院李盛華教授研制的消腫止痛合劑。該藥在臨床使用多年，療效顯著，但機(jī)制尚未清楚[9,10]。課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，消腫止痛合劑使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelialgrowth factor,VEGF）、Notch和Dll4 蛋白表達(dá)量顯著升高，促進(jìn)新生血管生成和皮瓣成活[11]。I/R本是一類綜合征，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，從單一的靶點(diǎn)很難有效的緩解或治愈。因此，深入研究整體調(diào)節(jié)、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)作用機(jī)制且毒副作用小的藥物，是I/R治療中新的策略和方法。課題組探討消腫止痛合劑PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響機(jī)制，從而尋找中藥治療皮瓣I/R的作用靶點(diǎn)?，F(xiàn)對(duì)近幾年自噬對(duì)皮瓣成活率影響進(jìn)行綜述，為后期的課題研究提供思路和參考。

1 自噬概述

自噬是細(xì)胞對(duì)內(nèi)外界環(huán)境壓力變化的一種反應(yīng)，是細(xì)胞通過(guò)單層或雙層膜，包裹待降解物形成自噬體，然后運(yùn)送到溶酶體形成自噬，溶酶體并進(jìn)行多種酶的消化及降解，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新過(guò)程[12,13]。自噬是一種高度保守的真核細(xì)胞再循環(huán)過(guò)程，可降解胞質(zhì)大分子和細(xì)胞器，在血管生成、氧化應(yīng)激和凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。自噬調(diào)節(jié)多種內(nèi)皮細(xì)胞受體的表達(dá)，包括神經(jīng)纖維蛋白的降解，然后促進(jìn)血管生成[15]。自噬是發(fā)生在所有真核細(xì)胞[14]中的一個(gè)穩(wěn)態(tài)過(guò)程。在一個(gè)動(dòng)態(tài)循環(huán)系統(tǒng)中，自噬產(chǎn)生新的構(gòu)建模塊和能量用于細(xì)胞更新和穩(wěn)態(tài)[16]。然而，不適當(dāng)?shù)淖允煽蓳p害血管生成[17]。自噬在調(diào)節(jié)血管生成、凋亡和氧化應(yīng)激中起著重要作用，抑制自噬可以促進(jìn)血管生成，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死的氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物，如活性氧（reactive oxygen species, ROS）[18]是自噬的重要激活物[16]。但是自噬在細(xì)胞存活中的作用是一把“雙刃劍”，其在許多疾病中被激活以促進(jìn)細(xì)胞存活，如急性心肌梗死，但過(guò)度激活自噬可能引發(fā)細(xì)胞死亡[19]。

2 自噬與皮瓣缺血再灌注損傷

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)溶酶體分解代謝的過(guò)程，在維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要的作用[20]。自噬調(diào)節(jié)的完整性、有序性有利于維持細(xì)胞的生理功能[21]，I/R是指由于缺血肢體、組織、器官恢復(fù)血供后，出現(xiàn)的更加嚴(yán)重的損傷，自噬作為I/R的主要作用機(jī)制，揭示了細(xì)胞內(nèi)修復(fù)及損傷的過(guò)程，而這在I/R的發(fā)生發(fā)展中尤為重要。

2.1 自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤逆轉(zhuǎn)藥物有益作用

3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine；3-MA）是一種眾所周知特異性的自噬抑制劑[22-24]， 其首次被發(fā)現(xiàn)是通過(guò)從饑餓大鼠分離的肝細(xì)胞中篩選出來(lái)的嘌呤相關(guān)物質(zhì)[24,25]。在皮瓣自噬中，3-MA抑制自噬，進(jìn)一步提高皮瓣的成活率。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor, FGF21）、丹參酚酸B、芹菜素、樺木酸、二甲雙胍、骨化三醇和天麻素均[26-32]能使皮瓣自溶蛋白相關(guān)蛋白CTSD、基質(zhì)金屬蛋白酯（matrix metalloprotein ester,MMP9）、VEGF、SOD1、eNOS和HO1的表達(dá)水平升高，增加Cadherin5血管密度，使p62、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、Bax、CYC和 CASP3的表達(dá)水平降低，增加血管生成，抑制氧化應(yīng)激和凋 亡。FGF21激活A(yù)MPK-FoxO3a-SPK2-CARM1和AMPK-mTOR信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)TFEB表達(dá)增加，從而增強(qiáng)缺血皮瓣的組織自噬[26]。芹菜素通過(guò)促進(jìn)血管生成、抑制氧化應(yīng)激和凋亡來(lái)促進(jìn)隨機(jī)皮瓣的存活，進(jìn)而提高皮瓣存活率[27]。綜上所述，F(xiàn)GF21等藥物主要通過(guò)增強(qiáng)自噬，促進(jìn)血管生成，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡促進(jìn)皮瓣的成活。目前，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于3-MA在臨床應(yīng)用的報(bào)道。如果在臨床中阻斷自噬是有必要的，應(yīng)該確定更安全的替代方法。因此，需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定藥物調(diào)節(jié)自噬是否是一種安全的臨床治療方法。

2.2 TFEB核轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)自噬

TFEB是一種新的自噬和溶酶體生物發(fā)生的積極調(diào)節(jié)因子，其可通過(guò)激活A(yù)MPKα和內(nèi)皮細(xì)胞的自噬來(lái)調(diào)節(jié)血管生成[33]。假人參皂苷F11（pseudo ginsenoside F11, PF11）可通過(guò)上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax和C-caspase3表達(dá)，增加SOD1、HO1和eNOS、VPS34、Beclin1、LC3II和CTSD的表達(dá)水平。PF11通過(guò)AMPK-mTOR信號(hào)通路增加TFEB的核轉(zhuǎn)位，最終誘導(dǎo)自噬，增加自噬通量，促進(jìn)皮瓣血管生成，減輕氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)皮瓣的成活[34]。利拉魯肽通過(guò)ampk mcoln1-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)通路激活TFEB，導(dǎo)致其去磷酸化和核轉(zhuǎn)位，從而激活隨機(jī)皮瓣組織中的自噬[35]。有研究發(fā)現(xiàn)艾塞那肽激活A(yù)MPK-mTOR和amp-skp2-carm1信號(hào)通路，促進(jìn)TFE3核易位，激活自噬，增加MMP9、VEGF和Cadherin 5表達(dá)水平，降低IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC、GSDMD-N和Caspase-1的表達(dá)，增強(qiáng)血管生成，減少氧化應(yīng)激，抑制焦亡，最終改善皮瓣存活[36]。由此可見(jiàn)，TFEB的核轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)自噬升高或降低其相應(yīng)蛋白水平，均可促進(jìn)皮瓣成活。

2.3 多區(qū)域穿支皮瓣自噬

穿支皮瓣是指僅以管徑細(xì)?。?.5～0.8 mm）的皮膚穿支血管供血的皮瓣[37]。隨著嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷等引起的皮膚缺損尺寸的增大，應(yīng)設(shè)計(jì)更大區(qū)域的穿支皮瓣來(lái)覆蓋巨大的皮膚缺損。因此，尋找一種有效的方法來(lái)提高多區(qū)域穿支皮瓣的存活率非常必要。使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素聯(lián)合丁苯酞治療穿支皮瓣，雷帕霉素治療的所有組，均表現(xiàn)出過(guò)度自噬狀態(tài)，即皮瓣壞死面積增加，血管生成減少，細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激顯著增加[38]。經(jīng)丁苯酞單獨(dú)處理發(fā)現(xiàn)激光多普勒血流計(jì)值提高，VEGF、CDH5、 MMP9、SOD1、eNOS和HO1表達(dá)增加，Bax、CYC和CASP3表達(dá)減少，丁苯酞可以抑制自噬，改善血管生成，減少氧化應(yīng)激和凋亡，促進(jìn)多區(qū)域穿支皮瓣模型大鼠皮瓣存活[38]。因此，丁苯酞抑制自噬可能是提高多區(qū)域穿支皮瓣存活率的一種新機(jī)制。法舒地爾可通過(guò)增加beclin-1、降低p62和LC3Ⅰ/LC3Ⅱ，提高細(xì)胞自噬水平，促進(jìn)穿支皮瓣成活；緩激肽可以通過(guò)增加血管生成、促進(jìn)NO釋放、抑制細(xì)胞凋亡、減少氧化應(yīng)激和抑制自噬來(lái)促進(jìn)多區(qū)域穿支皮瓣的存活[39]。羥基紅花黃A（HSYA)可降低自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3II、VPS34、CTSD、p62等的表達(dá)水平，增強(qiáng)DH5、MMP9和VEGF的水平，促進(jìn)穿支皮瓣的血管生成[41]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α；HIF-1α）可誘導(dǎo)多區(qū)域穿支皮瓣自噬，而自噬增加可激活細(xì)胞凋亡，增加氧化應(yīng)激，對(duì)術(shù)后早期穿支皮瓣生存產(chǎn)生不利影響[42]。因此，將自噬調(diào)控到最佳水平可能是治療 IR的關(guān)鍵，但尚無(wú)研究證實(shí) IR不同病程階段的最佳自噬水平，有待未來(lái)的研究繼續(xù)探索。

2.4 自噬減輕缺血再灌注損傷

氧化應(yīng)激和自噬凋亡是IR的兩個(gè)主要機(jī)制[11]，是導(dǎo)致隨意皮瓣壞死的關(guān)鍵因素。有研究顯示，缺血后處理對(duì)皮瓣再灌注損傷有保護(hù)作用，該作用可能和自噬激活有關(guān)[43]。白藜蘆醇（resveratrol, Rev）上調(diào)beclin1、LC3II、VPS34和CTSD的表達(dá)，降低SQSTM1/p62的水平，這表明它激活皮瓣的自噬，顯著提高皮瓣的存活率[44]。研究表明骨化三醇具有抗炎作用，通過(guò)加速血管生成、減少氧化應(yīng)激和上調(diào)自噬水平來(lái)促進(jìn)皮瓣存活[45]。也有報(bào)道稱，黃芪甲苷通過(guò)增加平均血管密度，上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)水平，抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)，降低炎癥蛋白TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，增加SOD活性，降低MDA含量，刺激自噬[46]。因此，藥物激活自噬，增加血管生成，抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激促進(jìn)皮瓣成活。自噬是IR的重要病理機(jī)制之一，可以被眾多中藥復(fù)方、中藥單藥及中藥活性成分調(diào)控。IR的進(jìn)展與皮瓣自噬異常密切相關(guān)，故治療重在恢復(fù)皮瓣的正常自噬。

2.5 PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)皮瓣成活

PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛存在于各類細(xì)胞中，是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡、分化調(diào)節(jié)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其異?；罨苁苟喾N下游底物被激活，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞向惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲能力，并可抑制細(xì)胞凋亡[47]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路在皮瓣自噬發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用[48]，心蓮內(nèi)酯和姜黃素通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路減少隨機(jī)模式皮瓣的凋亡，二者皆能有效增加皮瓣中自噬蛋白LC3II、beclin1的表達(dá)，降低p62的表達(dá)水平，促進(jìn)氧化應(yīng)激指標(biāo)HO1、eNOS和SOD1表達(dá)，降低凋亡因子CYC、Bax、CASP3水平，促進(jìn)新生血管、降低氧化應(yīng)激、抑制凋亡過(guò)程來(lái)提高隨機(jī)皮瓣的存活率[48,49]。Sit可以通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬，能夠抑制穿支皮瓣的抗凋亡作用，增強(qiáng)促血管生成和抗氧化應(yīng)激來(lái)促進(jìn)其生存[50]。由此可見(jiàn)，自噬可能具有改善穿支皮瓣生存的潛力，PI3K/Akt信號(hào)通路可增強(qiáng)皮瓣自噬，促進(jìn)皮瓣成活起著關(guān)鍵作用。

3 總結(jié)與展望

目前對(duì)于皮瓣I/R中皮瓣自噬的研究較少。本文分別從自噬抑制劑3-MA、TFEB核轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)自噬、多區(qū)域穿支皮瓣自噬、自噬減輕缺血再灌注損傷、PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)皮瓣成活5個(gè)方面著手進(jìn)行歸納總結(jié)，系統(tǒng)闡述了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以及傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷中皮瓣自噬的研究現(xiàn)狀。目前通過(guò)自噬抑制劑3-MA逆轉(zhuǎn)藥物作用，對(duì)比相應(yīng)藥物對(duì)皮瓣自噬的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加血管的生成，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)和減少細(xì)胞凋亡促進(jìn)皮瓣存活率。值得注意的是，HIF-1α可誘導(dǎo)多區(qū)域穿支皮瓣自噬，而自噬增加可激活細(xì)胞凋亡，增加氧化應(yīng)激，對(duì)術(shù)后早期穿支皮瓣生存產(chǎn)生不利影響，但是HIF-1α對(duì)于皮瓣血管生成的增加作用大于激活細(xì)胞凋亡和增加氧化應(yīng)激對(duì)皮瓣的不利。與此相比，Sit誘導(dǎo)的自噬抑制了穿支皮瓣的抗凋亡作用，但仍能增強(qiáng)促血管生成和抗氧化應(yīng)激來(lái)促進(jìn)其生存，眾多研究表明自噬對(duì)I/R具有雙向調(diào)節(jié)作用，自噬清除體內(nèi)受損細(xì)胞和代謝產(chǎn)物等的過(guò)程實(shí)質(zhì)是機(jī)體自主調(diào)節(jié)的表現(xiàn)，這一平衡是維持機(jī)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生理機(jī)能協(xié)調(diào)的基礎(chǔ)。目前對(duì)于增強(qiáng)或抑制自噬對(duì)皮瓣I/R的研究還停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，如果需要在臨床上使用藥物來(lái)調(diào)節(jié)自噬，需要確定藥物的濃度或確定更安全的替代方法。

皮瓣I/R是皮瓣移植術(shù)后皮瓣壞死的主要原因，是經(jīng)常困擾臨床醫(yī)生的難題。近年來(lái)，I/R損傷的相關(guān)防治被廣泛研究，但皮瓣缺血再灌注損傷涉及多種損傷機(jī)制。文章重點(diǎn)討論了自噬在皮瓣缺血再灌注損傷中的作用，歸納自噬對(duì)皮瓣I/R的保護(hù)作用及相應(yīng)機(jī)制。綜上所述，自噬在皮瓣I/R中并非單一的機(jī)制作用，各種機(jī)制相互協(xié)同，相互促進(jìn)，形成一系列的反應(yīng)來(lái)促進(jìn)皮瓣的成活。但是，自噬對(duì)皮瓣缺血再灌注的保護(hù)作用及具體的機(jī)制目前仍然不清楚。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)研究證實(shí)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在腦組織缺血缺氧后調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。前期課題組就消腫止痛合劑對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷的研究未考慮自噬與其相關(guān)作用，目前課題組基于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路探討消腫止痛合劑對(duì)皮瓣缺血再灌注的機(jī)制研究，為中藥治療皮瓣壞死提供依據(jù)。相信隨著深入的研究，找到自噬通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，揭示皮瓣缺血再灌注中自噬的機(jī)制，為I/R的治療提供新的思路。