骨重建逆轉(zhuǎn)期細(xì)胞事件及偶聯(lián)因子再歸類

孫東亮，董萬濤*，李興勇

（1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730030；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，蘭州 730030；3甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730030）

骨骼的完整性由不斷重復(fù)的骨吸收和骨形成過程維持，稱為骨重建?；径嗉?xì)胞單位（basic multicellular units, BMUs）是偶聯(lián)吸收和形成這兩種不可分割活動(dòng)的微觀結(jié)構(gòu)。骨重建失衡學(xué)說[1]是目前被廣泛接受的骨質(zhì)疏松發(fā)病理論，其認(rèn)為骨形成-吸收平衡被打破，吸收大于形成從而導(dǎo)致骨質(zhì)減少及強(qiáng)度下降，但是這種理論忽略了骨吸收與形成間的偶聯(lián)關(guān)系。例如雙膦酸鹽和地諾單抗等抗吸收藥，由于偶聯(lián)作用同時(shí)損害骨形成，因此增大發(fā)生長(zhǎng)期不良事件的可能性[2]。間歇性甲狀旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）等骨形成藥物以及PTH相關(guān)蛋白療法也會(huì)刺激骨吸收，使其在使用兩年后合成代謝作用不足[3]。因此了解偶聯(lián)機(jī)制對(duì)于抗骨質(zhì)疏松藥物的作用模式及其局限性尤為重要。

最近在人體樣本上進(jìn)行的BMUs偶聯(lián)現(xiàn)象的實(shí)時(shí)可視化模型[4]，明確了逆轉(zhuǎn)期的存在和其中發(fā)生的細(xì)胞事件。逆轉(zhuǎn)細(xì)胞通過在骨重建部位產(chǎn)生成骨環(huán)境，成為破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞偶聯(lián)的中介，并通過表型轉(zhuǎn)換將骨吸收逆轉(zhuǎn)為骨形成。這一過程包括3個(gè)在時(shí)間和空間上有序的細(xì)胞事件：骨吸收期，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞激活、增殖、表型轉(zhuǎn)換的逆轉(zhuǎn)期及骨形成期。

細(xì)胞分泌或基質(zhì)偶聯(lián)因子在特定位置和時(shí)間精細(xì)地相互作用，是實(shí)現(xiàn)骨重建偶聯(lián)過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)維持骨骼穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，本文依據(jù)骨重建模型重新歸類逆轉(zhuǎn)期出現(xiàn)的偶聯(lián)因子，為尋找符合偶聯(lián)規(guī)律的藥物靶點(diǎn)提供廣闊前景。

1 逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的性質(zhì)

逆轉(zhuǎn)細(xì)胞是成骨細(xì)胞前體或譜系細(xì)胞，來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是處于不同分化、增殖、遷移階段的骨祖細(xì)胞，可逐漸分化為成骨細(xì)胞[5]。在電子顯微鏡下，觀察到破骨細(xì)胞附近的早期逆轉(zhuǎn)細(xì)胞位于破骨細(xì)胞下方，并與破骨細(xì)胞的質(zhì)膜發(fā)生直接接觸。因此它們理想地暴露于破骨細(xì)胞釋放的偶聯(lián)因子中[6]。早期逆轉(zhuǎn)細(xì)胞表現(xiàn)為促吸收表型，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）[7]，這些MMPs有助于破骨細(xì)胞打開礦化骨基質(zhì)的通道和降解上層非礦化膠原蛋白。此外，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞產(chǎn)生核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand, RANKL）[8]，這是早期成骨細(xì)胞的典型細(xì)胞因子，這種RANKL在幾個(gè)調(diào)節(jié)水平上促進(jìn)破骨細(xì)胞的吸收[9]。分化晚期逆轉(zhuǎn)細(xì)胞囊泡很少，成為成熟成骨細(xì)胞，表型轉(zhuǎn)化為促合成型，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如骨保護(hù)素（osteoprotegerin, OPG）等，抑制破骨細(xì)胞增殖分化促進(jìn)其凋亡，在成人骨重建中發(fā)揮作用[10]。

2 基本多細(xì)胞單位及骨重建模型

骨重建的過程是由基本多細(xì)胞單位（BMUs）實(shí)現(xiàn)的，是進(jìn)行骨形成-吸收的微觀功能單位，包含破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的功能性細(xì)胞團(tuán)簇[11]，其誘導(dǎo)形成的骨質(zhì)吸收和形成發(fā)生在骨表面，哈弗氏管內(nèi)皮質(zhì)表面、髓腔內(nèi)表面和骨小梁表面[12]。

2.1 基于基本多細(xì)胞單位的骨重建模型

利用骨皮質(zhì)內(nèi)哈弗氏BMUs的方向平行于長(zhǎng)骨干長(zhǎng)軸的特點(diǎn)，研究9名（平均年齡13.9歲）接受髖關(guān)節(jié)矯正手術(shù)的患者股骨樣本，以及10名成年人（平均年齡55.4歲）的腓骨樣本，對(duì)具有重建活性的哈弗氏系統(tǒng)的表面，切取20~60個(gè)相鄰的3.5 μm厚的縱向切片；用抗酒石酸抗性酸性磷酸酶（TRACP）或組織蛋白酶K（CatK）免疫組織化學(xué)染色，以標(biāo)示破骨細(xì)胞的位置及數(shù)量；原位雜交技術(shù)檢測(cè)堿性磷酸酶、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2和III型膠原的表達(dá)，以標(biāo)示骨祖細(xì)胞的位置及數(shù)量；對(duì)這些組合信息三維重建后獲得連續(xù)、完整、自然的單個(gè)BMUs骨重建模型[4]。該模型類似于一個(gè)錐型隧道，基于細(xì)胞事件可劃分為以下3個(gè)階段。

骨吸收期：大量破骨細(xì)胞緊密排列在錐型隧道頂端，被定義為原發(fā)破骨細(xì)胞，這種啟動(dòng)骨重建周期的原發(fā)破骨細(xì)胞主要促進(jìn)沿隧道軸線的初始吸收。

逆轉(zhuǎn)期：在原發(fā)破骨細(xì)胞遷移后的吸收軌跡附近，出現(xiàn)大量逆轉(zhuǎn)細(xì)胞定植，而伴隨逆轉(zhuǎn)細(xì)胞出現(xiàn)的是在錐形隧道壁上增殖的破骨細(xì)胞，稱為繼發(fā)破骨細(xì)胞，其作用為促進(jìn)錐型隧道直徑加寬的再吸收。繼發(fā)破骨細(xì)胞與逆轉(zhuǎn)細(xì)胞混合存在直到骨形成期開始，這種細(xì)胞混合的骨表面被稱為逆轉(zhuǎn)再吸收表面。三維重建后使用直徑來計(jì)算初始吸收期末和逆轉(zhuǎn)再吸收期末達(dá)到的隧道橫截面積，再吸收期的吸收量平均為全部骨總吸收量的83%以上，說明逆轉(zhuǎn)期骨吸收量是重建周期整體吸收的主要貢獻(xiàn)者。沿著逆轉(zhuǎn)期的縱軸的細(xì)胞定量顯示，破骨細(xì)胞密度沿著縱軸隨時(shí)間逐漸減少，在骨形成期開始時(shí)，其幾乎完全消失。而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的密度隨時(shí)間逐漸增加，在增殖到每毫米39個(gè)細(xì)胞這個(gè)閾值時(shí)，骨形成期開始。比較多個(gè)BMUs發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的募集越慢，骨形成的啟動(dòng)越晚，再吸收區(qū)域的長(zhǎng)度越長(zhǎng)直徑越寬，在骨重建周期中產(chǎn)生的暫時(shí)性骨缺損就越高。逆轉(zhuǎn)細(xì)胞募集率是啟動(dòng)骨合成和關(guān)閉骨吸收的關(guān)鍵。對(duì)35名女性（年齡17～78歲）進(jìn)行的分析表明，延遲偶聯(lián)或解偶聯(lián)造成的再吸收區(qū)域的加長(zhǎng)和增寬，對(duì)年齡導(dǎo)致的骨丟失的貢獻(xiàn)最大[13]。

骨形成期：由大量靠近類骨質(zhì)的逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖、分化后形成的成熟成骨細(xì)胞構(gòu)成，可以產(chǎn)生類骨質(zhì)和礦物質(zhì)沉積，周圍不存在破骨細(xì)胞。

利用該模型，能夠獲得從最初的吸收事件到骨沉積開始的整個(gè)細(xì)胞事件的真實(shí)圖像，BMUs作為一個(gè)功能連續(xù)體揭示了：骨基質(zhì)經(jīng)歷多個(gè)吸收階段，逆轉(zhuǎn)期越來越多的逆轉(zhuǎn)細(xì)胞被招募，一旦達(dá)到閾值細(xì)胞密度，就啟動(dòng)骨形成并關(guān)閉骨吸收。

2.2 基于基本多細(xì)胞單位局部細(xì)胞的重建模型

BMUs局部細(xì)胞包含具有相鄰關(guān)系的骨襯細(xì)胞、骨髓被膜/冠層細(xì)胞、骨髓毛細(xì)血管周細(xì)胞。骨襯細(xì)胞（bone-lining cells, BLC）是預(yù)先存在于靜止骨表面的細(xì)胞，相關(guān)研究[14]已經(jīng)確認(rèn)BLC來源的逆轉(zhuǎn)細(xì)胞，是成人正常骨轉(zhuǎn)換過程中的骨祖細(xì)胞。骨髓被膜（bone marrow envelope, BME）即紅骨髓周圍的一層間充質(zhì)干細(xì)胞，其覆蓋在BLC上稱為冠層細(xì)胞。免疫組織化學(xué)和原位雜交顯示BME表達(dá)早期成骨細(xì)胞譜系標(biāo)志，如平滑肌肌動(dòng)蛋白（smooth muscle actin, SMA）[15]；此外它們分泌RANKL等早期成骨細(xì)胞系的典型因子[9]。相關(guān)研究[16]表明作為骨祖細(xì)胞儲(chǔ)存庫的BME的破壞，與絕經(jīng)后或糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的骨丟失相關(guān)。與BME臨近的骨髓毛細(xì)血管也是逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的來源之一。這些毛細(xì)血管與H型血管（一種骨特異性微血管亞型）或過渡血管相同，后者在小鼠模型中被廣泛研究與骨形成的關(guān)系，這些毛細(xì)血管也可能是骨祖細(xì)胞循環(huán)至骨重建部位的通道[17]。骨形成減少的情況是否可能與毛細(xì)血管的缺陷有關(guān)還有待研究，但在H血管缺失的小鼠長(zhǎng)骨中，骨骼生長(zhǎng)停止。在皮質(zhì)骨移植模型中，骨髓毛細(xì)血管周細(xì)胞從生態(tài)位通過跨皮質(zhì)血管遷移至骨重建部位，并促進(jìn)新的成骨細(xì)胞形成和骨管閉合[18]。

基于股骨皮質(zhì)內(nèi)多個(gè)BMUs連續(xù)切片，按時(shí)間順序進(jìn)行三維重建后，得到破骨細(xì)胞侵蝕骨表面，激活逆轉(zhuǎn)細(xì)胞引起局部變化的時(shí)間模型[19-22]：在垂直于骨表面的橫截面上，單個(gè)破骨細(xì)胞在向左移動(dòng)時(shí)侵蝕骨表面，隨時(shí)間間隔不同的逆轉(zhuǎn)細(xì)胞變化。第一階段：破骨細(xì)胞接近骨表面靜止的BLC和處于休眠狀態(tài)的BME，隨著破骨細(xì)胞的移動(dòng)，BLC發(fā)生收縮而BME會(huì)被抬高，兩者同時(shí)被激活；第二階段：破骨細(xì)胞經(jīng)過后，BLC受趨化因子吸引，擴(kuò)散增殖到破骨細(xì)胞的吸收軌道上，成為了侵蝕骨表面的逆轉(zhuǎn)細(xì)胞，而BME細(xì)胞變成了與毛細(xì)血管接觸的冠層，通過不斷增殖成為逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的儲(chǔ)存庫；第三階段：逆轉(zhuǎn)細(xì)胞通過募集（BLC增殖、BME增殖、血管周細(xì)胞遷移等）使密度增加，早期分化開始；第四階段：逆轉(zhuǎn)細(xì)胞分化為成熟成骨細(xì)胞并沉積類骨質(zhì)。值得注意的是，這種成熟成骨細(xì)胞在離破骨細(xì)胞很遠(yuǎn)的地方看到，說明激活逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的是原發(fā)破骨細(xì)胞（圖1）。

圖1 破骨細(xì)胞侵蝕骨表面，激活逆轉(zhuǎn)細(xì)胞引起局部變化的重建模型Fig.1 Osteoclasts erode the bone surface, activating reversal cells and causing local changes in the reconstruction model

3 基于骨重建模型分類偶聯(lián)因子

骨重建模型中的逆轉(zhuǎn)期是骨吸收期與骨形成期的銜接過程，逆轉(zhuǎn)期內(nèi)多種細(xì)胞因子或骨基質(zhì)因子，通過逆轉(zhuǎn)細(xì)胞激活、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換3個(gè)過程，完整偶聯(lián)破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成作用。依據(jù)骨重建模型重新歸類偶聯(lián)因子，可為多種疾病如骨質(zhì)疏松、骨性關(guān)節(jié)炎等疾病，提供更加精準(zhǔn)的治療周期和靶點(diǎn)。

3.1 逆轉(zhuǎn)細(xì)胞激活期

原發(fā)破骨細(xì)胞對(duì)局部逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的激活，是逆轉(zhuǎn)期開啟的關(guān)鍵。Sims等[23]發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞通過直接的細(xì)胞間接觸或分泌因子調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞行為、存活和分化，并增加成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的遷移和增殖。

3.1.1 軸突引導(dǎo)因子3

軸突引導(dǎo)因子SLIT3是一種排斥性分子，可通過與其受體Robo1（一個(gè)叫Roundabout 1的跨膜蛋白）相互作用，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起到精確引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元遷移的作用[24]。近期的體外和動(dòng)物在體研究[25]表明通過上調(diào)破骨細(xì)胞NF-κB p50和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，可增加SLIT3的分泌，并通過激活β-連環(huán)蛋白，在骨重建逆轉(zhuǎn)期的早期階段增加成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的遷移和增殖。缺乏SLIT3或其受體Robo1的小鼠表現(xiàn)出骨形成損傷和骨吸收激活引起的骨質(zhì)疏松表型。重要的是破骨細(xì)胞特異性Slit3缺陷小鼠的骨量減少，而神經(jīng)元中缺乏SLIT3的小鼠的骨量不變，這表明SLIT3是骨微環(huán)境中一種局部生成和激活的耦合因子。此外，SLIT3以自分泌的方式抑制破骨細(xì)胞的生成，這表明它可能也參與逆轉(zhuǎn)期晚期階段抑制骨吸收的作用。

3.1.2 補(bǔ)體 C3

破骨細(xì)胞衍生的補(bǔ)體C3被裂解為誘導(dǎo)成骨細(xì)胞生成的C3a[26]。C3的表達(dá)在破骨細(xì)胞生成過程中上調(diào)，C3a受體 (C3AR) 拮抗劑減弱了破骨細(xì)胞衍生條件培養(yǎng)基的成骨活性，而 C3AR激動(dòng)劑促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。在卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥或與RANKL一起給藥時(shí)，骨中的C3表達(dá)顯著上調(diào)。在這些情況下，C3AR 拮抗劑會(huì)減弱骨形成活動(dòng)，加速骨丟失。

3.1.3 鞘氨醇1-磷酸

鞘氨醇1-磷酸（sphingosine-1-phosphate, S1P）是一種具有廣泛生物活性的鞘磷脂代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞增生、運(yùn)動(dòng)、存活的過程中扮演重要的角色。骨形態(tài)發(fā)生蛋白6（bone morphogenetic protein 6，BMP6）是TGF-β /BMP 超家族成員，主要由肝臟產(chǎn)生。BMP6通過增強(qiáng)PTH或維生素D誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞骨鈣素表達(dá)[27]。Pederson等[28]發(fā)現(xiàn)在破骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells, hMSCs）向成骨細(xì)胞系遷移和分化。在成熟多核破骨細(xì)胞中，鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1, SPHK1）顯著增加，該激酶催化鞘氨醇磷酸化形成S1P。S1P誘導(dǎo)骨祖細(xì)胞募集并促進(jìn)成熟細(xì)胞存活。同時(shí)成熟破骨細(xì)胞中Wnt10b和BMP6也顯著增加，而硬化蛋白水平在分化過程中降低。破骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)hMSCs細(xì)胞的遷移和分化被Wnt拮抗劑Dkk1（一種BMP6中和抗體）和S1P拮抗劑減弱。說明破骨細(xì)胞可以通過SIP和BMP6將骨祖細(xì)胞招募到骨重建部位，并通過增加Wnt/BMP通路的激活刺激骨形成。

3.1.4 心肌營(yíng)養(yǎng)素-1

心肌營(yíng)養(yǎng)因子-1（cardiotrophin-1，CT-1）是白介素-6超家族的gp130信號(hào)細(xì)胞因子，在心臟生物學(xué)、肝臟發(fā)病機(jī)制和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能中發(fā)揮重要功能，而在骨組織中CT-1僅由破骨細(xì)胞表達(dá)，可與成骨細(xì)胞中的gp130受體結(jié)合，增加成骨細(xì)胞活性和礦化，在正常骨吸收和新生兒骨形成至關(guān)重要，CT-1缺陷小鼠由于成骨細(xì)胞數(shù)量減少而表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松表型[29]。這些發(fā)現(xiàn)表明，CT-1可能是一個(gè)關(guān)鍵的破骨細(xì)胞分泌的耦合因子，促進(jìn)成骨細(xì)胞活動(dòng)。

3.2 逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖期

逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的不斷增殖促進(jìn)繼發(fā)破骨細(xì)胞形成及功能，由繼發(fā)破骨細(xì)胞造成的再吸收是重建周期整體骨吸收量主要貢獻(xiàn)者，由此釋放的骨基質(zhì)因子也成為逆轉(zhuǎn)細(xì)胞繼續(xù)遷移、增殖、分化的重要介質(zhì)。Hikita等[30]發(fā)現(xiàn)微環(huán)境中成骨細(xì)胞膜結(jié)合形式的RANKL可以促進(jìn)局部破骨細(xì)胞的形成，而可溶性RANKL在生理上沒有意義。Tang等[31]研究發(fā)現(xiàn)從再吸收基質(zhì)中釋放產(chǎn)生的TGF通過激活下游靶點(diǎn)，可將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞募集到BMUs內(nèi)。

3.2.1 核因子-κB受體活化因子配體

RANKL也稱為破骨細(xì)胞分化因子和OPG配體（OPGL），在成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、活化T淋巴細(xì)胞和淋巴結(jié)中高度表達(dá)[32]。RANKL與破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體表面的同源受體NF-κB受體激活因子（nuclear factor-κB receptor activating factor, RANK）結(jié)合，導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化、融合和激活[33]。缺乏RANK或RANKL的小鼠是彼此的表型復(fù)制品，表明這種RANKL/RANK信號(hào)軸在骨重建中的重要作用[32,33]。因此，阻斷RANKL信號(hào)被認(rèn)為是治療骨質(zhì)疏松性骨丟失和相關(guān)骨骼疾病的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。

3.2.2 巨噬細(xì)胞集落刺激因子

巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-sti-mulating factor, M-CSF）是一種造血生長(zhǎng)因子，促進(jìn)單核吞噬細(xì)胞系（包括破骨細(xì)胞）存活、增殖、分化和移動(dòng)[34]。M-CSF由成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌，與破骨細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面的同源受體C-FMS結(jié)合。在CSF1基因中插入胸腺嘧啶核苷導(dǎo)致M-CSF缺乏的骨質(zhì)疏松小鼠中，巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量在幼年時(shí)減少。然而，這些表型在衰老過程中消失。在成骨細(xì)胞中注射重組M-CSF或產(chǎn)生可溶性M-CSF可增加破骨細(xì)胞的數(shù)量并挽救骨質(zhì)疏松小鼠的骨質(zhì)表型，這表明M-CSF對(duì)破骨細(xì)胞的形成至關(guān)重要，至少在年輕小鼠中是如此，但并不排除M-CSF非依賴性代償機(jī)制的存在。

3.2.3 Wnt通路

Wnt通路通過連環(huán)蛋白依賴（規(guī)范）和非依賴（非規(guī)范）通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞生成，對(duì)維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在成骨細(xì)胞系細(xì)胞中高度表達(dá)一種非酪氨酸Wnt配體Wnt5A，并與破骨細(xì)胞表面的同源受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2（Ror2）結(jié)合。小鼠Wnt5a或Ror2雜合性缺失導(dǎo)致骨髓源性單核細(xì)胞（BMM）向成熟破骨細(xì)胞的發(fā)育受損[35]。在Wnt5a的成骨細(xì)胞特異性缺失或Ror2的破骨細(xì)胞特異性缺失的小鼠中也觀察到相應(yīng)的破骨細(xì)胞生成缺陷。Wnt5a通過激活Jun CN末端激酶（JNK）MAPK途徑上調(diào)破骨細(xì)胞中的RANK表達(dá)，從而增強(qiáng)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。

3.2.4 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

TGF-β1是骨基質(zhì)中最豐富的蛋白質(zhì)之一，通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞促進(jìn)骨重建。在骨基質(zhì)中，TGF-β1與潛伏期相關(guān)蛋白 (LAP) 非共價(jià)結(jié)合，通過掩蓋 TGF-β1的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域使其處于潛伏狀態(tài)[36]。因此，TGF-β1在骨基質(zhì)中處于非活性狀態(tài)，并響應(yīng)破骨細(xì)胞的骨吸收而從骨基質(zhì)中釋放出來?；钚?TGF-β1將骨祖細(xì)胞募集到吸收表面并將它們分化為成骨細(xì)胞。

3.2.5 胰島素樣生長(zhǎng)因子

胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）是另一種沉積在骨基質(zhì)中的生長(zhǎng)因子，與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)結(jié)合。在破骨細(xì)胞骨吸收過程中，酸性pH值會(huì)激活從骨基質(zhì)釋放的 IGF-1。發(fā)現(xiàn)骨基質(zhì)衍生的IGF-1通過激活成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞中的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo) (mTOR) 來促進(jìn)成骨[37]。值得注意的是，老年大鼠骨基質(zhì)中的IGF-1濃度低于年輕大鼠，這表明骨體積和 IGF-1水平之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3.2.6 含膠原三螺旋重復(fù)蛋白1

含膠原三螺旋重復(fù)蛋白1（Cthrc1）最初是在動(dòng)脈壁中發(fā)現(xiàn)的，只有在頸動(dòng)脈和主動(dòng)脈受損時(shí)，其基因表達(dá)才被誘導(dǎo)。在成年期，基礎(chǔ)Cthrc1表達(dá)高度局限于大腦和骨基質(zhì)破骨細(xì)胞[38]。作為成熟破骨細(xì)胞吸收骨基質(zhì)后釋放的可溶性蛋白，靶向骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化[39]。當(dāng)成熟破骨細(xì)胞接觸羥基磷灰石和鈣時(shí)，Cthrc1表達(dá)上調(diào)。雖然成骨細(xì)胞中的Cthrc1受體尚未確定，但重組Cthrc1可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的募集和成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成。與此一致，Cthrc1的破骨細(xì)胞特異性缺失導(dǎo)致骨量減少，骨形成減少。

3.3 逆轉(zhuǎn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化期

在逆轉(zhuǎn)后期骨吸收逐漸減少，與此相一致的是破骨細(xì)胞數(shù)量減少，而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞變得更加豐富，從而失去了它們的促吸收表型[7]，甚至轉(zhuǎn)化為抗破骨細(xì)胞，因?yàn)樵诜只^程中其OPG的表達(dá)水平增加了7倍，OPG/RANKL比率增加了35倍[40]。當(dāng)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖達(dá)到類骨質(zhì)沉積所需的每毫米39個(gè)細(xì)胞這個(gè)閾值密度時(shí)，破骨細(xì)胞完全消失，骨吸收完全停止，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖率決定了骨形成開始的時(shí)間[4]。而如果逆轉(zhuǎn)細(xì)胞密度一直達(dá)不到閾值無法開啟骨形成時(shí)，就會(huì)持續(xù)存在額外骨吸收事件的風(fēng)險(xiǎn)，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞雙向作用持續(xù)存在[41]。

3.3.1 骨保護(hù)素

骨保護(hù)素（OPG）也稱為破骨細(xì)胞生成抑制因子和TNF受體超家族成員。OPG是一種分泌型糖蛋白，由多種細(xì)胞合成，包括成骨細(xì)胞、肺或肝細(xì)胞以及骨髓中的B淋巴細(xì)胞。由于破骨細(xì)胞的形成受到抑制，OPG的過度表達(dá)導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)增加，而OPG缺陷小鼠由于破骨細(xì)胞的發(fā)育增加而表現(xiàn)出出生后快速的骨丟失和嚴(yán)重的骨孔隙度，OPG被認(rèn)為是與RANKL結(jié)合的誘餌受體，通過阻斷RANKLRANK相互作用負(fù)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和激活[42]。

3.3.2 信號(hào)素SEMA3A

信號(hào)素最初被認(rèn)為是參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的軸突導(dǎo)向因子，但它們也在各種生理過程中發(fā)揮作用，包括成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞的相互作用。研究表明[43]SEMA3A在骨骼建模和重建中也起著關(guān)鍵作用，特別是感覺神經(jīng)元衍生的SEMA3A對(duì)于體內(nèi)正常骨形成是必需的，在缺乏OPG的成骨細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中檢測(cè)到高水平的SEMA3A，其與神經(jīng)肽-1（NRP1）的結(jié)合抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，并通過Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。由成骨細(xì)胞系細(xì)胞產(chǎn)生的SEMA3A通過同步抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成而發(fā)揮有效的骨保護(hù)因子的作用[44]。

3.3.3 Wnt通路

Wnt16位點(diǎn)與人類的骨密度（bone mineral density, BMD）、皮質(zhì)骨厚度和骨折風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[45]。Wnt16在位于皮質(zhì)骨的成骨細(xì)胞中高度表達(dá)，但在破骨細(xì)胞中幾乎沒有表達(dá)[46]。Wnt16的整體缺失導(dǎo)致皮質(zhì)骨量的具體減少和皮質(zhì)孔隙度的增加，以及小梁骨沒有改變的自發(fā)性骨折。Wnt16以直接和間接的方式抑制破骨細(xì)胞的生成。除了通過非規(guī)范的JNK MAPK途徑直接抑制破骨細(xì)胞生成外，Wnt16誘導(dǎo)的JUN磷酸化上調(diào)成骨細(xì)胞中OPG的表達(dá)，提供抑制破骨細(xì)胞生成的直接機(jī)制。小鼠中Wnt16的成骨細(xì)胞特異性缺失以其整體缺失的表型復(fù)制小鼠，表明成骨細(xì)胞是Wnt16的主要來源，對(duì)皮質(zhì)骨和骨骼完整性有影響。

3.3.4 肝配蛋白-促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞受體

肝配蛋白（erythropoietin producing hepatomocellular receptor interacting protein, Ephrin）與靶細(xì)胞膜上的促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞受體（erythropoietin producing hepatocyte, Eph）結(jié)合介導(dǎo)的雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在細(xì)胞功能中起關(guān)鍵作用。在骨重建過程中，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞通過細(xì)胞間的直接接觸進(jìn)行交流。這種相互作用可以由膜表面表達(dá)的Ephrin信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)，這對(duì)于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的雙向通訊至關(guān)重要[47]。細(xì)胞膜表面蛋白Ephrin B (B1—B3) 與其同源酪氨酸激酶受體EPHB (B1—B6) 結(jié)合。Ephrin B家族由具有細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白組成，它與EPHB的相互作用介導(dǎo)雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[48]。Ephrin B2在破骨細(xì)胞表面表達(dá)，與成骨細(xì)胞膜表面蛋白EPHB4結(jié)合。反向信號(hào)傳導(dǎo)（成骨細(xì)胞到破骨細(xì)胞）由EPHB4介導(dǎo)的Ephrin B2激活啟動(dòng)，并通過阻斷破骨細(xì)胞中C-FOS/NFATC1通路來抑制破骨細(xì)胞分化。在前向信號(hào)（破骨細(xì)胞到成骨細(xì)胞）中，Ephrin B2介導(dǎo)的EPHB4激活促進(jìn)成骨細(xì)胞分化并抑制細(xì)胞凋亡[49]。類似地，成骨細(xì)胞中EPHB4的過表達(dá)會(huì)增加轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的骨量[47]。

3.3.5 信號(hào)素4D

信號(hào)素4D（ semaphorin 4D, SEMA4D）是一種軸突引導(dǎo)分子，也在破骨細(xì)胞中表達(dá)。破骨細(xì)胞衍生的SEMA4D與成骨細(xì)胞表面的受體 (plexin-B1) 結(jié)合，抑制成骨細(xì)胞分化。缺乏SEMA4D的小鼠骨量增加，骨形成活動(dòng)增加，骨強(qiáng)度增強(qiáng)。Plexin-B1缺陷小鼠也顯示出與Sema4d相似的骨表型-缺陷小鼠，表明 SEMA4D和Plexin-B1處于同一途徑中，從機(jī)制上講SEMA4D與PLXNB1的結(jié)合會(huì)激活小G蛋白調(diào)控因子（GTPase RHOA），然后通過減弱IGF-1信號(hào)傳導(dǎo)來抑制成骨細(xì)胞分化[50]。施用抗 SEMA4D抗體可防止絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中的骨質(zhì)流失并促進(jìn)骨形成而不影響破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，這表明SEMA4D是骨質(zhì)疏松癥或其他低骨量疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

4 總結(jié)和展望

骨重建周期研究的主要目的是探究骨吸收與骨形成之間的偶聯(lián)關(guān)系，新的重建模型完善了逆轉(zhuǎn)期的存在和作用機(jī)制。在重建的起點(diǎn)，原發(fā)破骨細(xì)胞激活的局部逆轉(zhuǎn)細(xì)胞具有分解代謝表型；逆轉(zhuǎn)細(xì)胞通過BLC增殖、冠層細(xì)胞增殖、血管周細(xì)胞遷移等途徑逐漸募集，由逆轉(zhuǎn)細(xì)胞激活的繼發(fā)破骨細(xì)胞成為重建周期整體吸收的主要貢獻(xiàn)者；逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的密度隨時(shí)間逐漸增加，失去分解代謝特性，轉(zhuǎn)變?yōu)楦呒?xì)胞密度的合成代謝表型，超過臨界細(xì)胞密度時(shí)開始成骨；說明逆轉(zhuǎn)細(xì)胞募集率是關(guān)閉骨吸收和啟動(dòng)骨合成的關(guān)鍵。新模型也證明了逆轉(zhuǎn)期延遲偶聯(lián)或去偶聯(lián)，造成的“缺乏骨形成的啟動(dòng)”比“骨形成開始后形成幅度低”對(duì)骨丟失的影響更大。偶聯(lián)因子作用各異，甚至其作用是矛盾的，用原有的吸收與形成模型難以解釋，通過骨重建模型揭示逆轉(zhuǎn)期的作用，并對(duì)逆轉(zhuǎn)期涉及的細(xì)胞間分子機(jī)制的深入了解，必將使我們更清楚地理解調(diào)節(jié)吸收和形成之間微妙而關(guān)鍵的平衡因素。這些在人類骨骼中的新發(fā)現(xiàn)，將對(duì)過度骨質(zhì)丟失或增加相關(guān)的骨骼疾病的發(fā)病機(jī)制和未來的治療研究做出貢獻(xiàn)。