敲除S1PR3可緩解小鼠的急性肺損傷：基于抑制MAPK信號通路

房尚萍，袁 冉，孫任珂，馬同軍

皖南醫(yī)學院1麻醉學院，2麻醉學實驗實訓中心，3法醫(yī)學院，安徽 蕪湖 241002

膿毒癥是病原微生物入侵機體后所致的全身炎癥反應綜合征［1,2］。肺臟是膿毒癥中受累的首位靶器官［3］。在病程早期就可出現(xiàn)急性肺損傷，其發(fā)生率在危重病人群中高達7%。死亡率高達30%～40%，已成為膿毒癥患者死亡的首要原因［4］。鞘氨醇1磷酸酯受體3（S1PR3）作為G蛋白偶聯(lián)受體之一，與磷脂分子-1磷脂鞘氨醇結(jié)合，啟動細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導，調(diào)節(jié)細胞增殖和炎癥反應［5,6］。S1PR3在全身各組織器官內(nèi)高表達［7］。有研究報道S1PR3是參與膿毒癥過程巨噬細胞清除細菌的關(guān)鍵分子［8］。當干擾S1PR3表達可抑制LPS誘導的小膠質(zhì)細胞TNF-α、IL-6和IL-1β表達［9］。研究顯示S1PR3在急性肺損傷中是關(guān)鍵的分子［10］。

S1PR3 在膿毒性急性肺損傷的具體機制尚不明確。因此，本研究通過脂多糖（LPS）構(gòu)建急性肺損傷模型，觀察了敲除S1PR3和S1PR3激動劑對急性肺損傷的影響，及是否通過MAPK通路發(fā)揮作用，為急性肺損傷的治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 脂多糖（Sigma），S1PR3激動劑CYM-5541（MedChemExpress）；caspase-1 抗體、clv-GSDMD 抗體，p-JNK抗體、p-ERK抗體、p-p38抗體（Cell Signaling Technology）；ELISA試劑盒（武漢艾美捷科技有限公司）。

1.1.2 實驗動物 健康SPF級雄性C57Bl/6J小鼠16只和S1PR3-/-敲除鼠16只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物使用許可證號SCXK（京）2019-0010，本實驗動物研究符合皖南醫(yī)學院實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準，動物倫理批準號為2021-201，實驗遵循3R原則。

1.2 方法

1.2.1 急性肺損傷模型構(gòu)建［11］所有小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（0.20 mL/20 g）麻醉小鼠，固定于動物架上，置于工作臺，抬高頭端，使其與操作臺面成30°角，用寬頭鑷拉出舌頭，充分暴露聲門，向氣管內(nèi)緩慢滴注LPS/NS（5 mg/kg），保持小鼠直立體位，直至完全吸入，恢復正常呼吸，造模后6 h，處理小鼠。

1.2.2 動物分組 雄性C57BL/6J 小鼠（6～8 周）分為2組：C57 NS組（C57，生理鹽水處理）、C57 LPS組（C57，LPS誘導），8只/組；S1PR3敲除雄性小鼠（6～8周）分為2 組：S1PR3-/-NS 組（S1PR3 敲除鼠，生理鹽水處理）、S1PR3-/-LPS組（S1PR3敲除鼠，LPS誘導）。

1.2.3 細胞分組 Ⅱ型肺泡上皮細胞（MLE-12細胞）鋪板于6孔板中，每孔細胞數(shù)量為1×106，分為4組，每組3個副孔：PBS 組、LPS 組、CYM5541 組（僅加入CYM-5541）、CYM5541+LPS 組（加入CYM-5541+LPS），CYM-5541（10 nmol/L）預刺激2 h，加入LPS（1 μg/mL）刺激6 h。

1.2.4 HE染色 4%福爾馬林固定肺組織，石蠟包埋，切成5 mm切片。然后，用HE染色切片。

1.2.5 Western blot 各組收集的肺組織或細胞，PBS清洗2次，加入RIPA試劑，蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑提取組織總蛋白，BCA法測量蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，將條帶分貝加入caspase-1，GSDMD，p-JNK，p-ERK p-p38 和內(nèi)參抗體中，4 ℃避光孵育過夜，1×TBST洗膜3次，5 min/次，再置于二抗（1∶1000）孵育液中，室溫孵育1 h，最后ECL顯影液避光顯影，使用Image J軟件進行結(jié)果分析，通過目的蛋白灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.2.6 RT-qPCR 使用Trizol 法提取肺組織或細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后行PCR擴增。擴增條件：95 ℃3 min，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)。引物序列如下（表1）。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR

1.2.7 肺水腫檢測 采用肺濕干比反應肺水腫情況。小鼠麻醉后右心灌流去除肺部血管內(nèi)血液，取肺臟并稱重，記作濕重。將肺臟至于65 ℃恒溫烤箱，72 h再次稱重，記作干重。

1.3 統(tǒng)計學分析

SPSS 22.0 軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組間比較用獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。所有的實驗都是獨立重復3次。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導的急性肺損傷中S1PR3表達上調(diào)

S1PR3在LPS處理的C57小鼠肺組織中表達明顯上升（圖1A，P＜0.001），同時pro-IL-18，pro-IL-1β，TNF-α，IL-6 mRNA表達明顯上升（圖1B～C，P＜0.05），小鼠血清IL-18，IL-1β較空白對照組均明顯升高（圖1D，P＜0.05）。

圖1 急性肺損傷對S1PR3和炎癥因子的影響Fig.1 Effect of acute lung injury on S1PR3 and inflammatory factors in C57 mice.A-C:qRT-PCR for detecting changes of S1PR3,pro-IL-18,pro-IL-1β,TNF-α,and IL-6 mRNAexpression in lung tissues.D:ELISAfor detecting changes of IL-18 and IL-1β expressions in serum.*P＜0.05,***P＜0.001 vs ctrl group

2.2 S1PR3敲除改善急性肺損傷出血

S1PR3-/-較WT小鼠經(jīng)LPS刺激后的肺組織HE染色，肺損傷明顯減輕（圖2A～E）。同時WT和S1PR3-/-經(jīng)LPS刺激后肺臟濕干比值均顯著升高（圖2F，P＜0.05），而S1PR3-/-較WT小鼠經(jīng)LPS刺激后的肺濕干比重明顯降低。

圖2 S1PR3敲除對急性肺損傷病理的影響Fig.2 Effect of S1PR3 knockout on lung pathology in mice with acute lung injury.A-D:HE staining of the lung tissues.E: Percentage of neutrophil infiltration.F: Lung wet/dry ratio.@P＜0.05 vs WT LPS Group.

2.3 S1PR3會加重細胞焦亡比例

S1PR3敲除后的小鼠急性肺損傷，血清乳酸脫氫酶（LDH）（圖3A）和肺泡巨噬細胞的凋亡比例（圖3B）均降低,cleaved-caspase-1和GSDMD蛋白表達（圖3C～E）也較WT小鼠急性肺損傷時表達降低。II型肺泡上皮細胞因加入LPS 和S1PR3 激動劑后，細胞上清中的LDH 含量（圖3I）明顯升高，cleaved caspase-1 和GSDMD（圖3F～H）蛋白表達也明顯上升（P＜0.05）。

圖3 S1PR3對急性肺損傷細胞焦亡的影響Fig.3 Pyroptosis in the lung tissue of S1PR3 knockout mice with acute lung injury and in MLE-12 cells treated with S1PR3 agonist.A: Changes of serum LDH levels in WT and S1PR3-/-mice.B:Flow cytometry for detecting pyroptosis of alveolar macrophages in mice with acute lung injury.C-E: Western blotting for detecting changes in GSDMD and cleaved caspase-1 p20 in the lungs of mice with acute lung injury(In Fig.3C,A,B,C and D represent WT Ctrl group,WT LPS group,S1PR3-/- Ctrl group,and S1PR3-/- LPS group,respectively).F-H:Western blotting for detecting changes in GSDMD and cleaved caspase-1 p20 in MLE-12 cells treated with CYM5541.I: Changes of LDH levels in MLE-12 cell supernatant.#P＜0.05 vs PBS Group,@P＜0.05 vs WT LPS Group,*P＜0.05,***P＜0.001 vs CYM5541+LPS group.

2.4 S1PR3敲除降低MAPKs通路的激活

急性肺損傷的小鼠肺組織中的p-JNK、p-ERK和p-p38表達均明顯增強，而S1PR3敲除后減輕了這些分子的磷酸化（P＜0.05，圖4A～D）。而II型肺泡上皮細胞因加入LPS后MAPKs家族蛋白的磷酸化水平明顯升高，而同時加入S1PR3激動劑和LPS后，MAPKs家族蛋白的磷酸化水平較單獨加入LPS升高更明顯（P＜0.05，圖4E～H）。

圖4 S1PR3對MAPKs信號通路的影響Fig.4 Changes in MAPKs signal pathway in the lung tissue of S1PR3 knockout mice with acute lung injury and in MLE-12 cells treated with S1PR3 agonist.A-D:Western blotting for detecting changes in p-p38,p-JNK and p-ERK in the lungs of the mice with acute lung injury(in Fig.4A,A,B,C and D represent WT Ctrl group,WT LPS group,S1PR3-/-Ctrl group,and S1PR3-/-LPS group,respectively).E-H:Western blotting for detecting changes in p-p38,p-JNK and p-ERK in MLE-12 cells treated with CYM5541.#P＜0.05 vs PBS Group,@P＜0.05 vs WT LPS Group,*P＜0.05 vs CYM5541+LPS group.

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)S1PR3促進急性肺損傷發(fā)展，通過caspase-1經(jīng)典的細胞焦亡途徑，通過抑制S1PR3表達會抑制caspase-1細胞焦亡途徑，抑制急性肺損傷的發(fā)展；反之，過表達S1PR3促進caspase-1細胞焦亡途徑，促進急性肺損傷的發(fā)展。

脂多糖作為革蘭陰性桿菌細胞壁外膜內(nèi)毒素的主要成分，是引起膿毒癥和急性肺損傷的主要致病因素［12,13］。本研究中，向氣管內(nèi)注入LPS直接誘導急性肺損傷，病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS滴注氣管后導致大量炎癥細胞浸入肺泡腔和肺毛細血管充血，肺泡壁增厚；同時，血清炎癥因子TNF-α，IL-6，IL-1β明顯升高，說明急性肺損傷的模型構(gòu)建成功，該結(jié)果與某報道一致［14］。S1PR3廣泛分布于各類組織細胞中，是七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族的其中一員，與磷脂分子1-磷酸鞘氨醇（S1P）相結(jié)合，啟動下游信號轉(zhuǎn)導，可調(diào)節(jié)細胞增殖，炎癥等生物學功能［10,14］。本研究發(fā)現(xiàn)急性肺損傷后S1PR3表達明顯升高，該結(jié)果與某研究結(jié)果類似：急性肺損傷小鼠血漿中S1PR3明顯上升［10］。出現(xiàn)該結(jié)果的可能機制是S1PR3通過介導細胞增殖和增強血管通透性。而在S1PR3-/-小鼠急性肺損傷中，肺組織滲出的炎癥細胞和毛細血管充血程度明顯減輕。研究發(fā)現(xiàn)S1PR3拮抗劑能抑制小膠質(zhì)細胞炎癥因子的產(chǎn)生，從而抑制膿毒性腦病的發(fā)生發(fā)展［16］，該現(xiàn)象與本結(jié)果類似。說明S1PR3可促進膿毒癥的發(fā)生發(fā)展，而敲除S1PR3能明顯緩解膿毒癥的進程。

本研究發(fā)現(xiàn)S1PR3-/-急性肺損傷小鼠，肺組織細胞焦亡比例明顯減少，分泌的LDH明顯降低，炎癥反應明顯減輕。與本研究結(jié)果類似的研究顯示S1PR2缺失的急性肺損傷巨噬細胞焦亡減少，膿毒癥的發(fā)生明顯減輕［17］。S1PR2和S1PR3均是S1PRs家族中的主要成員，高度同源，具有相似的生物學效應［18,19］。但S1PR3缺失是否通過減輕細胞焦亡，而減緩膿毒癥的發(fā)生鮮有報道，這也是本研究的創(chuàng)新點之一。細胞焦亡是一種促炎性的細胞死亡方式，細胞在感受到外來信號刺激后，激活炎性小體［20］，caspase-1前體蛋白被剪切，形成具有活性的caspase-1，同時剪切IL-1β和IL-18前體形成具有生物活性的成熟體［20,21］。同時Caspase-1通過剪切g(shù)asdermin D(GSDMD)蛋白誘導細胞焦亡，細胞腫脹發(fā)生滲透性溶解［22］。本研究發(fā)現(xiàn)S1PR3-/-小鼠膿毒性肺損傷后，肺組織GSDMD及clv-caspase-1等焦亡相關(guān)蛋白明顯減少。II型肺泡上皮細胞是肺泡上皮細胞的主要組成細胞，是參與急性肺損傷的重要效應細胞［23］，因此本實驗采用II型肺泡上皮細胞系MLE-12細胞模擬體外實驗。CYM5541 是選擇性S1P 受體3 的變構(gòu)激動劑，能模擬S1PR3過表達后的生物學效應［24］。本研究發(fā)現(xiàn)MLE-12細胞加入LPS和CYM5541后，細胞焦亡相關(guān)蛋白表達明顯升高，與S1PR3敲除后現(xiàn)象相反。說明S1PR3會促進細胞焦亡的發(fā)生。

MAPKs家族是介導細胞內(nèi)信號傳導的一組絲氨酸/蘇氨酸激酶，該通路被激活后會導致細胞增殖、分化、死亡和促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生等效應［25,26］。MAPKs通路也被認為是急性肺損傷的關(guān)鍵信號［27,28］。目前鮮有研究報道MAPKs家族在S1PR3介導的急性肺損傷的發(fā)展中起作用。Tian等發(fā)現(xiàn)JNK、ERK和p38在急性膿毒癥肝損傷模型中被活化，而MAPKs通路會被S1PR3抑制劑所抑制［29］，該研究與本研究結(jié)果類似，JNK、ERK和p38MAPKs家族在急性肺損傷時被激活，而S1PR3敲除小鼠的急性肺損傷中MAPK通路被抑制。S1PR3激動劑會使MAPKs通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平升高。

綜上所述，敲除S1PR3通過抑制MAPKs信號通路抑制細胞焦亡，從而改善膿毒性急性肺損傷。