ALDH2 通過線粒體融合與裂變減輕脂多糖誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細胞屏障的損傷

王莎莎，呂 恒，王麗婭，田美惠，高 潔，劉忠義，王佳慧，于 影

蚌埠醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)教研室，2心腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床重點實驗室，3流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233000

膿毒癥相關(guān)性腦病（SAE），是膿毒癥常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其相關(guān)重要機制極為復(fù)雜，包括內(nèi)皮屏障受損、線粒體的功能障礙、神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活以及鞘磷脂代謝紊亂或異常等［1］。血腦屏障（BBB）［2］是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵屏障系統(tǒng)，由周細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞（BMECs）、星形細胞末端足、基底板細胞、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞組成。其中BMECs通過緊密連接蛋白構(gòu)成內(nèi)皮細胞屏障，對維持BBB的完整性尤為重要［3］。緊密連接蛋白主要由跨膜蛋白，如閉鎖帶狀蛋白ZO、咬合蛋白Occludin、閉合蛋白Claudin以及連接黏附分子JAM等組成［4］。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖（LPS）誘導(dǎo)SAE產(chǎn)生活性氧ROS［5］，引起細胞間緊密連接被破壞，ZO-1、Occludin蛋白表達下降，內(nèi)皮細胞通透性增加，造成神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙［6］。

乙醛脫氫酶2（ALDH2）是位于線粒體基質(zhì)內(nèi)重要的醛類氧化酶，催化乙醛氧化為乙酸。值得注意的是，敲除ALDH2小鼠因腦內(nèi)皮細胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）降低，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，引起內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白ZO-1和Occludin丟失，內(nèi)皮屏障通透性增加［7］；而在高氧誘導(dǎo)的人微血管內(nèi)皮細胞采用ALDH2激動劑Alda-1干預(yù)，可通過抑制氧化應(yīng)激的增加，恢復(fù)線粒體膜電位并改善線粒體功能［8］。

線粒體在生理狀態(tài)下，處于不斷地融合、分裂動態(tài)平衡中［9］。線粒體的融合蛋白家族成員包含視神經(jīng)萎縮蛋白OPA1、線粒體融合蛋白Mfn2；線粒體的分裂蛋白包括動力相關(guān)蛋白Drp1、線粒體分裂蛋白Fis1等。已有研究表明，線粒體融合和分裂參與了多種細胞活動，如氧化應(yīng)激［10-12］、細胞凋亡［13-15］、吞噬有絲分裂［15-17］等。抑制Drp1可以逆轉(zhuǎn)線粒體形態(tài)變化，降低ROS水平，明顯改善了BBB破壞和腦水腫［18］。而Mfn2通過抑制炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定細胞間連接，維持內(nèi)皮屏障的完整性［19］，這表明線粒體融合和分裂與內(nèi)皮細胞屏障存在一定聯(lián)系。在心肌細胞中研究顯示［20］，ALDH2可以通過調(diào)控線粒體分裂蛋白Drp1，抑制線粒體分裂發(fā)揮保護作用。采用線粒體分裂蛋白抑制劑可減弱LPS誘導(dǎo)的膿毒癥時，肺臟［21］、腦組織［22］氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，改善線粒體的功能。然而，有關(guān)ALDH2改善LPS導(dǎo)致的腦微血管內(nèi)皮細胞損傷，相關(guān)報道較少。特別是ALDH2能否通過調(diào)控線粒體融合和分裂，抑制氧化應(yīng)激的增加，進而減輕內(nèi)皮細胞通透性？具體機制還不清楚。故本實驗通過給予ALDH2 激動劑Alda-1，觀察ALDH2 對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞損傷的影響，并探討線粒體融合和分裂在內(nèi)皮屏障中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（Procell）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清（Hyclone）；LPS（Sigma）；Alda-1（MCE）；Dihydroethidium 和DAPI（碧云天）；CCK8 檢測細胞增殖毒性試劑（Biosharp）；丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）氧化應(yīng)激檢測試劑盒（南京建成）；FITC-Dextran（Sigma）；DHE超氧化物陰離子熒光探針（碧云天）；ALDH2單克隆抗體、ZO-1多克隆抗體、Occludin單克隆抗體、OPA1多克隆抗體和Drp1多克隆抗體（Abcam）；Mfn2多克隆抗體和Fis1單克隆抗體（武漢三鷹）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（Biosharp）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 腦微血管內(nèi)皮細胞加入濃度為25 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基，其中包括10%的胎牛血清和雙抗（即青霉素和鏈霉素），在實驗操作過程中，按照約以3×104/cm2的密度，接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，最后放置于溫度為37 ℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞的密度長至約80%～90%左右時，將細胞進行傳代（1傳2），進行后續(xù)的實驗。

實驗分組：實驗分為3組，即（1）對照組：將腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基；（2）LPS損傷組（LPS）：LPS加入在DMEM完全培養(yǎng)基中，24 h后處理細胞；（3）LPS+ALDH2激動劑Alda-1組（LPS+Alda-1）：Alda-1藥物預(yù)先處理1 h，隨之將藥物LPS加入DMEM完全培養(yǎng)基中干預(yù)24 h。

1.2.2 CCK-8 檢測細胞活性 將bEnd.3 細胞密度以6000/孔，接種于96 孔板，分別加入LPS（0.1、0.5、1、5 μg/mL）和Alda-1（10、20、40、80、100 μmol/mL）藥物處理24 h后，每個孔加入含有110 μL 的CCK-8稀釋液，放置搖床上勻速混勻5 min，在培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，最后測定各組的A值（波長450 nm處）。

1.2.3 TEER電阻值的測定 每孔接種細胞2×105/mL，細胞貼壁生長48 h至單層融合后，利用ESR-電阻儀測量細胞TEER電阻值；在測量時，將電極插入小室中（上短下長），均取每孔細胞不同方向的3個點進行檢測。TEER=（內(nèi)皮細胞電阻值-基礎(chǔ)電阻值）×Transwell上室濾膜的底面積。

1.2.4 FITC-Dextran細胞通透性檢測 將腦微血管內(nèi)皮細胞按2×105/cm2接種于小室的濾膜上，待bEnd.3細胞待匯合成單層后，LPS和Alda-1藥物干預(yù)細胞24 h后，棄去小室中的培養(yǎng)基，下室加入無FITC 標記的葡聚糖的無血清DMEM 600 μL，上室中加入無血清DMEM配制的0.5 mg/mL FITC-Dextran 100 μL，孵育1 h后，在暗室下分別吸取各組上室和下室的溶液，各100 μL/孔，用多功能酶標儀檢測其熒光的A值（即激發(fā)的波長為485 nm、發(fā)射的波長為520 nm）。FITC-Dextran通透性的大小，用通透系數(shù)（Pa）表示，計算公式為：Pa=[A]/t×1/A×V/[L]，其中[A]表示下室的熒光值，t為FITC-Dextran的孵育時間（以秒計算為單位），A為FITC-Dextran濾過的面積（以cm2計算），V為下室無血清培養(yǎng)基體積，[L]代表上室熒光的A值。實驗結(jié)果均以Pa%表示，即Pa%=（檢測組Pa值/對照組Pa值）×100%。

1.2.5 SOD活性和MDA含量的測定 取藥物干預(yù)后的細胞上清液于新的1.5 mL于EP管中，接下來進行離心（3000 r/min 10 min），取適量于新的EP管中，按照試劑盒的說明書操作步驟，檢測腦內(nèi)皮細胞MDA的含量和SOD活性。

1.2.6 細胞免疫熒光ROS測定 將細胞接種于6孔板，按以1×105/孔的細胞密度接種培養(yǎng)，細胞生長至合適的密度后，LPS、Alda-1單獨或聯(lián)合藥物干預(yù)24 h后，棄去原有的培養(yǎng)基并用PBS清洗，隨后用4%的多聚甲醛固定細胞（30 min），清洗細胞3遍，5 min/遍；應(yīng)用DHE（超氧化物陰離子熒光探針）試劑按5 μmol/L 的濃度在37 ℃水浴鍋中孵育40 min，之后清洗細胞；接下來，DAPI染胞核5 min（5 μg/mL，37 ℃）左右并清洗細胞3遍，放置避光的盒子中，利用蔡司熒光倒置顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光強度的表達變化，并及時拍照保存。

1.2.7 Western blot實驗檢測各蛋白表達 細胞藥物干預(yù)24 h后，使用PBS清洗細胞，隨后加入提前配制好的裂解液和蛋白酶抑制劑（比例為100∶1）的混合液，上下左右搖晃培養(yǎng)皿，在冰上裂解5 min后，用手持型細胞刮刀刮取腦內(nèi)皮細胞，然后用1 mL量程的移液槍，收集細胞懸浮液至新的EP管中，振蕩離心，結(jié)束后吸取各組的蛋白上清液（200 μL EP管）。蛋白濃度檢測后，經(jīng)計算得出各組蛋白的上樣體積。取各組適量的蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，最后用牛奶封閉PVDF膜2 h。封閉結(jié)束后將條帶用TBST洗膜3遍，10 min/遍，隨后將PVDF膜分別與ALDH2（1∶2000）、ZO-1（1∶1000）、Occludin（1∶1000）、OPA1（1∶1500）、Mfn2（1∶8000）、Drp1（1∶1000）、Fis1（1∶3000）、GAPDH（1∶10 000）等一抗，4 ℃冰箱的搖床過夜；隔天上午用配制好的TBST洗膜3遍，10 min/遍，洗膜結(jié)束后，孵育蛋白二抗（1∶10 000），在室溫條件下，孵育1.5 h，最后洗膜并曝光。將顯影液與各條帶進行充分的接觸，即在盒子中靜置1 min后，使用Tanon-5200 Multi 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行圖像采集，并用Image J軟件對目的和內(nèi)參條帶，進行灰度值分析。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 將所有的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，利用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05時表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞活性變化

2.1.1 藥物濃度確定 CCK8結(jié)果顯示，LPS藥物干預(yù)24 h后，與Con組相比，隨著LPS藥物濃度的不斷增高，各藥物濃度的細胞活性逐漸下降（P＜0.001），其中LPS濃度為1 μg/mL時，細胞活性最低（P＜0.001），細胞損傷較強，故選取LPS藥物濃度為1 μg/mL進行實驗（圖1A）。加入Alda-1干預(yù)24 h后，與Con組相比，隨著Alda-1藥物濃度的不斷增高，細胞活性均明顯升高（P＜0.001）；結(jié)合我們實驗室前期研究基礎(chǔ)，選取20 μmol/mL 的Alda-1進行后續(xù)實驗（圖1B）。

圖1 各組腦微血管內(nèi)皮細胞細胞活性Fig.1 Viability of brain microvascular endothelial cells treated with different concentrations of LPS (A),Alda-1 (B) and both (C).Data are presented as Mean±SD(n=6).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs Con;##P＜0.01 vs LPS.

2.1.2 各組內(nèi)皮細胞活性的變化 CCK-8的結(jié)果顯示（圖1C），與對照組相比，LPS 組細胞活性下降（P＜0.001）。與LPS組相比，LPS+Alda-1組細胞活性增高（P＜0.01）。

2.2 ALDH2對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞通透性的影響

采用TEER法檢測細胞電阻值，結(jié)果如圖2A所示，與Con組相比，LPS組電阻值顯著降低（P＜0.05）；而使用ALDH2激動劑Alda-1預(yù)處理后，LPS+Alda-1組電阻值升高（P＜0.001）。進一步采用FITC-Dextran法觀察熒光滲漏A值變化，結(jié)果如圖2B所示，與Con組相比，熒光滲漏A值明顯增高（P＜0.05）；而使用ALDH2激動劑Alda-1 預(yù)處理后，LPS+Alda-1 組熒光值降低（P＜0.001）。

圖2 ALDH2對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞通透性的影響Fig.2 Effects of ALDH2 on LPS-induced increase of permeability of brain microvascular endothelial cells.TEER (A) and FITC-dextran permeability (B) of the cells.Data are presented as Mean±SD(n=6).*P＜0.05 vs Con;###P＜0.001 vs LPS.

2.3 ALDH2對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激的影響

采用MDA和SOD試劑盒檢測氧化應(yīng)激變化，如圖3所示，與Con相比，LPS組MDA含量的表達明顯升高（P＜0.01），然而SOD 的活性表達降低（P＜0.001）；與LPS組相比，LPS+Alda-1組結(jié)果反之，即MDA含量的表達明顯下降（P＜0.001），而SOD活性表達顯著升高（P＜0.01）。

圖3 各組細胞MDA、SOD水平比較Fig.3 Comparison of MDA(A)and SOD(B)levels in the cells.Data are presented as Mean±SD(n=6).**P＜0.01,***P＜0.001 vs Con,##P＜0.01,###P＜0.001 vs LPS.

2.4 ALDH2對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)活性氧ROS的影響

免疫熒光結(jié)果如圖4A所示，與Con相比，LPS組胞漿ROS的平均熒光強度增強（紅色，圖4B）（P＜0.01）；與LPS組相比，LPS+Alda-1組胞漿ROS的平均熒光強度弱（紅色，圖4B）（P＜0.05）。

圖4 各組腦微血管內(nèi)皮細胞ROS免疫熒光染色Fig.4 Immunofluorescence staining of ROS in the cells.A:Immunofluorescence staining of ROS(red)and DAPI(blue).B:Quantitative analysis of ROS fluorescence intensity(Mean±SD,n=5).**P＜0.01 vs Con;#P＜0.05 vs LPS.

2.5 ALDH2 對LPS 誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞中OPA1、Mfn2、Drp1和Fis1蛋白表達的影響

采用免疫印跡實驗檢測線粒體融合蛋白和線粒體分裂蛋白表達的變化，結(jié)果如圖5所示：與Con組相比，LPS 組OPA1 蛋白（P＜0.01）和Mfn2 蛋白（P＜0.001）表達明顯降低，Drp1（P＜0.001）和Fis1蛋白表達均顯著增高（P＜0.01）；而與LPS組相比，LPS+Alda-1組OPA1蛋白（P＜0.05）和Mfn2蛋白（P＜0.001）表達升高，Drp1蛋白（P＜0.001）和Fis1蛋白（P＜0.05）表達降低。

圖5 各組bEnd.3腦微血管內(nèi)皮細胞OPA1、Mfn2、Drp1和Fis1蛋白水平變化Fig.5 Expression of OPA1,Mfn2,Drp1 and Fis1 proteins in bEnd.3 cells in each group.Western blots of OPA1,Mfn2,Drp1,Fis1 and GAPDH(A).OPA1(B),Mfn2(C),Drp1(D),and Fis1 (E) protein levels are normalized by GAPDH levels (Mean±SD, n=5).**P＜0.01,***P＜0.001 vs Con;#P＜0.05,###P＜0.001 vs LPS.

2.6 ALDH2對LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞ALDH2和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin蛋白表達的影響

免疫印跡實驗檢測ALDH2、緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達的變化，結(jié)果如圖6所示：與Con組相比，LPS組ALDH2蛋白表達降低明顯（P＜0.001），與此同時，ZO-1蛋白（P＜0.001）和Occludin蛋白（P＜0.001）表達均降低顯著；使用ALDH2激動劑Alda-1預(yù)處理后，LPS+Alda-1組ALDH2（P＜0.01）、ZO-1（P＜0.01）和Occludin（P＜0.05）蛋白表達均明顯升高。

圖6 各組ALDH2、ZO-1、Occludin蛋白表達情況Fig.6 Expression of ALDH2,ZO-1,and occludin protein in each group.A:Western blots of ZO-1,occludin and GAPDH.B-D:ALDH2(B),ZO-1 (C),Occludin(D)protein levels normalized by GAPDH levels(Mean±SD,n=5).***P＜0.001 vs Con,#P＜0.05,##P＜0.01 vs LPS.

3 討論

腦微血管內(nèi)皮細胞之間的緊密連接是血腦屏障的基本結(jié)構(gòu)，是維持腦微環(huán)境內(nèi)穩(wěn)態(tài)的第一道屏障［23］。而緊密連接破壞和內(nèi)皮損傷是LPS誘導(dǎo)血腦屏障破壞的主要機制［24,25］。當ROS分泌和清除之間的平衡被打破時，ROS過度積累就會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激增加［26］，進而破壞內(nèi)皮屏障的完整性。本研究采用LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞損傷模型，結(jié)果顯示：與Con組相比，TEER電阻值降低而FITC-Dextran熒光滲漏值升高；氧化應(yīng)激因子MDA含量增高而SOD活性下降；ROS熒光強度表達增強；ZO-1和Occludin內(nèi)皮屏障緊密連接蛋白表達明顯降低，提示LPS可引起腦微血管內(nèi)皮細胞損傷顯著，促進氧化應(yīng)激產(chǎn)生，導(dǎo)致細胞通透性增加。

線粒體是細胞的“動力工廠”，也是真核動物細胞生物氧化、能量轉(zhuǎn)換的主要場所。生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)線粒體處于不斷地融合與分裂平衡中，對維持細胞功能起到重要作用［27,28］。已有研究表明線粒體融合和分裂是影響內(nèi)皮屏障的關(guān)鍵因素之一［22］。抑制線粒體融合或線粒體過度分裂會造成線粒體功能紊亂，導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，破壞線粒體膜電位［29］，進一步增加血管內(nèi)皮細胞膜通透性，使血管內(nèi)皮屏障功能遭到損害［30］。過表達OPA1能夠促進線粒體的融合，抑制氧化應(yīng)激，減少細胞凋亡，減弱內(nèi)皮細胞的損傷程度［31］。而體內(nèi)缺失線粒體融合蛋白Mfn2，會導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)破壞，血管內(nèi)皮細胞通透性增加，影響內(nèi)皮屏障的完整性［19］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，在腦微血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞共同培養(yǎng)的體外血腦屏障細胞模型中［22］，給予線粒體分裂蛋白Drp1抑制劑，可明顯降低線粒體ROS水平，改善線粒體的膜電位，降低LPS誘導(dǎo)的細胞通透性；同時體內(nèi)實驗［22］也表明分裂蛋白Drp1抑制劑可以上調(diào)腦組織中ZO-1和Occludin蛋白的表達。隨后Haileselassie等［22］研究發(fā)現(xiàn)，抑制Drp1-Fis1相互作用，可以減輕LPS誘導(dǎo)的原代腦微血管內(nèi)皮細胞通透性，促進緊密連接蛋白表達，進而保持血腦屏障的完整性。與此結(jié)果相似的是，我們采用LPS刺激腦微血管內(nèi)皮細胞損傷后，線粒體融合蛋白OPA1、Mfn2表達下降，分裂蛋白Drp1、Fis1表達升高，緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達降低，說明LPS抑制線粒體融合、促進線粒體分裂并且破壞內(nèi)皮屏障。

已有研究表明，ALDH2可以通過代謝4-羥基壬稀醛（4-HNE）和MDA等毒性醛類物質(zhì)，發(fā)揮間接抗氧化的作用，拮抗ROS生成，減輕乙醛及代謝產(chǎn)物對細胞的損傷［32］。作為ALDH2的激動劑Alda-1，可通過上調(diào)內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白及粘附連接蛋白的表達，改善內(nèi)皮屏障損傷［33］。Alda-1通過抗氧化作用清除機體內(nèi)ROS，抑制脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，促進細胞氧化還原平衡［34］。此外，線粒體ALDH2在防止4-HNE的積累、氧化應(yīng)激、細胞凋亡和線粒體膜損傷等方面發(fā)揮著重要作用。激動ALDH2可以明顯抑制肺微血管內(nèi)皮細胞免受氧化應(yīng)激，改善線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能，在急性肺損傷中發(fā)揮保護作用［8］。為進一步分析ALDH2是否通過調(diào)控線粒體融合和分裂減輕LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮屏障損傷，本研究使用Alda-1進行干預(yù)，結(jié)果顯示：與LPS組相比，LPS+Alda-1組TEER電阻值升高，F(xiàn)ITC-Dextran熒光滲漏值下降，MDA含量降低，SOD活性升高，ROS釋放減少，內(nèi)皮緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達增高，提示激動ALDH2可以減輕腦微血管內(nèi)皮屏障損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。同時，我們通過Western blot實驗還測定線粒體融合和分裂蛋白的表達情況，結(jié)果顯示：ALDH2蛋白表達增高時，線粒體融合蛋白Mfn2、OPA1升高，分裂蛋白Fis1、Drp1表達減少。說明ALDH2可能通過促進線粒體的融合和抑制線粒體的分裂，減少氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，減輕對腦內(nèi)皮屏障的破壞。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ALDH2 預(yù)處理可以抑制ROS的釋放，減輕LPS誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞屏障的損傷，其機制可能與維持線粒體融合和分裂平衡有關(guān)，二者之間相關(guān)機制還有待進一步探討。