超聲聯(lián)合Ki67分析Graves病患者131I治療后甲亢未愈或復(fù)發(fā)的相關(guān)因素

王月桂，洪理偉，呂國榮，楊舒萍，李 玲，黃學(xué)鵬，沈浩霖

1福建醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 320000；福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院2超聲科，3核醫(yī)學(xué)科，福建漳州 363005；4泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建 泉州 362000

甲狀腺功能亢進(jìn)（甲亢）的發(fā)病率約為1.2%［1,2］。約有70%～85%的甲亢是由Graves病（GD）所引起［3-5］。放射性131I治療可以快速緩解患者的甲亢癥狀，被視為當(dāng)前治療GD的有效手段［6-8］。但仍有8%～50%的患者面臨治療后甲亢未愈或復(fù)發(fā)需要二次治療的問題［9,10］。影響GD患者131I治療結(jié)局的相關(guān)因素一直受到關(guān)注［11-14］。既往研究表明，Ki67 可以反映細(xì)胞增值的情況［15,16］。Domoslawski等［17］認(rèn)為GD患者濾泡上皮細(xì)胞Ki67 表達(dá)水平明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者，Jessica等［18］的研究表明接受β受體阻滯劑治療的GD 患者Ki67表達(dá)減少。然而，GD患者濾泡上皮細(xì)胞Ki67 表達(dá)水平是否與131I治療結(jié)局相關(guān)以及能否作為反映治療反應(yīng)性的指標(biāo)，尚未見報道。本研究旨在聯(lián)合應(yīng)用超聲新技術(shù)，分析與甲亢未愈或復(fù)發(fā)相關(guān)的因素，了解甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Ki67表達(dá)與甲亢未愈或復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2020年1月～2021年11月在我院核醫(yī)學(xué)科就診的GD患者112例，年齡18～72歲。研究截止時間為2022年1月24日。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合GD診斷標(biāo)準(zhǔn)［19］；（2）無放射性131I治療禁忌證；（3）131I 治療相關(guān)資料、病理資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有甲狀腺手術(shù)史；（2）非首次接受131I治療；（3）伴發(fā)甲狀腺惡性腫瘤者；（4）病理資料不完整，未獲得Ki67結(jié)果；（5）研究截止時間到，服藥后未滿1年且未出現(xiàn)相關(guān)事件。

排除患者23例，其中12例為非首次接受131I治療；11例為研究截止時間到，服藥后未滿1年且未出現(xiàn)相關(guān)事件。最終納入患者89例，男性22例，女性67例，年齡45.0±14.0歲。

所有受試者均知情同意并簽署書面同意書。本研究得到福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（No.2020KYB138）。

1.2 131I治療后隨訪時間及結(jié)局事件定義

每位患者最長隨訪時間為1年，治療后1個月為隨訪開始時間。隨訪終止有以下3種情況：（1）患者每種事件首次出現(xiàn)的時間；（2）隨訪時間滿1年；（3）研究截止時間到。根據(jù)隨訪結(jié)果，結(jié)局分為甲亢未愈或復(fù)發(fā)（事件1）、早發(fā)甲狀腺功能減退（早發(fā)甲減）（事件2）及甲狀腺功能正?；蚴щS訪（刪失）3種。

1.3 Ki67結(jié)果

甲狀腺組織細(xì)針抽吸活檢術(shù)后，穿刺物應(yīng)用羅氏全自動免疫組化儀進(jìn)行細(xì)胞增殖指數(shù)Ki67染色，在顯微鏡（目鏡直徑為22 mm）高倍鏡（×400）下觀察。以每視野中≥200 個細(xì)胞為合格標(biāo)本，鏡下觀察切片：（1）鏡下細(xì)胞較多或存在明顯Ki67 熱點(diǎn)的切片，選取2～3 幅包含陽性率最高區(qū)域的視野計數(shù)；（2）鏡下細(xì)胞較少或無明顯Ki67 熱點(diǎn)的切片，選取包含切片中全部濾泡細(xì)胞的視野。Ki67 增殖指數(shù)=Ki67 陽性核的濾泡細(xì)胞數(shù)/濾泡細(xì)胞總數(shù)×100%。根據(jù)Ki67 增殖指數(shù)分為：Ki67表達(dá)陰性（增殖指數(shù)＜1%）、Ki67表達(dá)陽性（增殖指數(shù)≥1%）。

1.4 相關(guān)因素

1.4.1131I治療劑量 用計算劑量法確定131I給藥劑量，即根據(jù)甲狀腺質(zhì)量和甲狀腺攝131I率（RAIU）進(jìn)行計算［19］。每克甲狀腺組織的劑量范圍為80～150 uCi。口服131I活度(uCi)=[計劃量(uCi/g)×甲狀腺質(zhì)量(g)]/[最高RAIU或24h RAIU(%)]。攝碘率的計算采用以下公式：RAIU=[甲狀腺部位計數(shù)率（計數(shù)·min-1）-本底（計數(shù)·min-1）]/[標(biāo)準(zhǔn)源計數(shù)率（計數(shù)·min-1）-本底（計數(shù)·min-1）]×100%。

1.4.2 甲狀腺三維容積 使用GE LOGIQ E8的超聲診斷儀，三維容積探頭RAB-6。由上至下橫切掃查甲狀腺，選取最大橫切面后固定探頭，啟動三維超聲體積自動測量技術(shù)對甲狀腺進(jìn)行自動圖像采集并存儲，設(shè)備自動重建甲狀腺模擬模型并計算體積（cm3），從而獲得甲狀腺的三維容積。

1.4.3 甲狀腺腺體剪切波彈性速度值 使用SEMENS ACUSON Sequoia 512的超聲診斷儀，10L4相陣探頭。進(jìn)入彈性成像模式，選取一側(cè)甲狀腺最大縱切面，避開血管和結(jié)節(jié)，待圖像穩(wěn)定后定幀，在腺體中央由距上極5 mm處開始測量，每隔5 mm測一次，總共測3次，平均值為一側(cè)甲狀腺剪切波彈性速度值；同樣的方法測量另一側(cè)甲狀腺，雙側(cè)平均值即為該患者甲狀腺剪切波彈性速度值。

1.4.4 游離甲狀腺素（FT4）和游離三碘甲狀原胺酸（FT3），血清促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）水平 使用電化學(xué)發(fā)光免疫測定法（貝克曼，DXI800，美國）測量患者空腹過夜后靜脈血的FT3、FT4及TRAb水平。FT3正常范圍為3.10～6.80 pmol/L；FT4 正常范圍為7.5～21.1 pmol/L；TRAb正常范圍為＜1.75 IU/L。

1.4.5 患者臨床資料 記錄患者年齡、性別、甲亢病程、131I治療前是否服用過抗甲亢藥物（ATD）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)分析采用R version 4.0.5（http://www.rproject.org/）。經(jīng)Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)，本研究中年齡呈正態(tài)分布，以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用單因素方差分析；其它連續(xù)性變量為非正態(tài)分布，以Median[Q25，Q75]”表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；分類變量以“例（率）”表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。對于P＜0.05的非正態(tài)分布的連續(xù)性變量，進(jìn)一步采用Nemenyi法進(jìn)行兩兩組間比較。

用cmprsk包進(jìn)行競爭風(fēng)險回歸分析。計算甲亢未愈或復(fù)發(fā)的風(fēng)險比（HR）及95%置信區(qū)間（CI）。隨訪時間被用作相應(yīng)的模型中的時間尺度。根據(jù)單變量分析的結(jié)果（以P＜0.25為具有統(tǒng)計學(xué)意義），多變量模型針對以下變量進(jìn)行了調(diào)整。模型1納入年齡。為了研究Ki67表達(dá)與甲亢未愈或復(fù)發(fā)之間的關(guān)聯(lián)是否歸因于病程、用藥史和其它的相關(guān)因素，模型2在模型1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步納入了用藥史、131I劑量、甲狀腺三維容積、甲狀腺剪切波速度值及TRAb水平。

2 結(jié)果

2.1 患者基線特征，甲亢未愈或復(fù)發(fā)的累積風(fēng)險邊緣概率

最終入組患者有89例，其中甲亢未愈或復(fù)發(fā)27例，早發(fā)甲減50例，甲狀腺功能恢復(fù)正常1例，失隨訪11例?；颊叩幕€特征見表1，結(jié)果顯示，患者3組間的甲狀腺三維容積存在差異，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩組間分析顯示，甲亢未愈或復(fù)發(fā)組的甲狀腺容積大于其它兩組（P均＜0.05），而早發(fā)甲減組與另一組無明顯差異；其余各因素在3組中的分布情況無明顯差別（P均＞0.05）。累積風(fēng)險邊緣概率分析顯示131I治療300 d后，甲亢未愈或復(fù)發(fā)的發(fā)生概率約25%（圖1）。

表1 89例患者的臨床資料Table 1 Clinical data of the 89 patients

圖1 Graves病患者131I治療后發(fā)生甲亢未愈或復(fù)發(fā)及甲減的累積風(fēng)險邊緣概率Fig.1 Cumulative marginal risk probability of unhealed or recurrent hyperthyroidism and hypothyroidism in patients with Graves disease after131I treatment.

2.2 甲亢未愈或復(fù)發(fā)的相關(guān)因素

以早發(fā)甲減作為治療結(jié)局競爭事件，在單因素分析結(jié)果基礎(chǔ)上，模型1納入年齡后，顯示Ki67表達(dá)陽性組患者甲亢未愈或復(fù)發(fā)的風(fēng)險為表達(dá)陰性組患者的0.31倍，HR（95%CI）為0.31（0.13，0.73）。模型2 在模型1的基礎(chǔ)上繼續(xù)納入用藥史、131I劑量、甲狀腺三維容積、甲狀腺剪切波速度值、TRAb后，Ki67表達(dá)陽性組患者甲亢未愈或復(fù)發(fā)的風(fēng)險為表達(dá)陰性組患者的0.36倍，HR（95%CI）為0.36（0.15，0.86），而131I劑量及甲狀腺三維容積的HR（95%CI）分別為0.81（0.68，0.96），1.11（1.07，1.15），P均＜0.05（表2）。

表2 競爭風(fēng)險模型分析結(jié)果Table 2 Results of competitive risk model analysis

3 討論

131I是目前治療GD的有效手段［20］。然而，GD患者131I治療后甲亢未愈或復(fù)發(fā)仍是臨床難題。本研究的累積風(fēng)險邊緣概率分析證實(shí)131I治療300天后，甲亢未愈或復(fù)發(fā)的發(fā)生概率約25%（圖1），這部分患者臨床癥狀及相關(guān)并發(fā)癥未能得到理想的控制。131I治療GD的主要作用機(jī)制與腫瘤放射治療相似，利用射線破壞濾泡上皮細(xì)胞，以減少甲狀腺激素生成［21,22］。既往的研究認(rèn)為，患者性別、病程、治療前是否服用ATD藥物治療等均會影響治療結(jié)局，考慮跟患者甲狀腺對131I敏感性不同有關(guān)［23-25］。能否評估患者對131I治療的敏感性并制定相應(yīng)治療方案一直是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。Ki67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，細(xì)胞核分裂明顯，功能越活躍，Ki67表達(dá)水平就越高，主要用來評估腫瘤細(xì)胞對治療的敏感性［26,27］。本研究以接受首次131I治療的GD患者為研究對象，研究GD患者甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Ki67表達(dá)與甲亢未愈或復(fù)發(fā)的關(guān)系，目前尚未見報道。

早發(fā)甲減是131I治療的重要結(jié)局之一，因此本研究應(yīng)用競爭風(fēng)險模型進(jìn)行分析。由于患者給藥劑量是基于計劃量、攝碘率和有效半衰期等指標(biāo)計算，因此本研究僅將最終給藥劑量納入分析，以避免相關(guān)指標(biāo)共線性問題?；€資料分析顯示甲亢未愈或復(fù)發(fā)組的甲狀腺容積明顯較大，提示容積有可能是甲亢未愈或復(fù)發(fā)的重要因素，應(yīng)對其進(jìn)一步分析。與文獻(xiàn)報道一致，本研究結(jié)果顯示131I劑量為甲亢未愈或復(fù)發(fā)的保護(hù)因素，表明治療劑量越高，患者甲亢未愈或復(fù)發(fā)發(fā)生的危險性越低；而甲狀腺容積為危險因素，容積越大，患者甲亢未愈或復(fù)發(fā)發(fā)生的風(fēng)險越高，提示治療前有必要應(yīng)用容積測量技術(shù)對甲狀腺容積進(jìn)行準(zhǔn)確測量并調(diào)整好131I給藥劑量［9,28,29］。

此外，為了驗(yàn)證Ki67 與甲亢未愈或復(fù)發(fā)的關(guān)系，我們構(gòu)建了不同的模型進(jìn)行敏感性分析。為了觀察人口學(xué)特征的影響，模型1首先對年齡進(jìn)行調(diào)整，結(jié)果顯示，Ki67的HR由0.40下降為0.31，雖然降幅大于10%，但Ki67 與甲亢未愈或復(fù)發(fā)仍具有直接聯(lián)系（95%CI為0.13，0.73）。為進(jìn)一步觀察結(jié)局是否歸因于用藥史、131I劑量、甲狀腺三維容積、甲狀腺剪切波速度值和TRAb，模型2在模型1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對上述因素進(jìn)行調(diào)整，分析結(jié)果顯示，Ki67和甲亢未愈或復(fù)發(fā)的關(guān)聯(lián)是獨(dú)立于其他因素的，表明Ki67的表達(dá)與甲亢未愈或復(fù)發(fā)有直接關(guān)系。本研究初步證實(shí)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Ki67陽性表達(dá)的GD患者，甲亢未愈或復(fù)發(fā)發(fā)生的危險性較低?？紤]可能的機(jī)制為：Ki67陽性表達(dá)，細(xì)胞處于增殖期，對131I越敏感，細(xì)胞破壞越明顯［30］。Ki67可以作為反映細(xì)胞對131I是否敏感的潛在指標(biāo)。但納入樣本量偏少是本研究的主要不足之處，在接下來的研究中，我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并進(jìn)行多中心研究以進(jìn)一步驗(yàn)證Ki67與131I治療結(jié)局的關(guān)聯(lián)性。

甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Ki67表達(dá)陽性、131I給藥劑量及甲狀腺容積與131I治療后甲亢未愈或復(fù)發(fā)存在獨(dú)立關(guān)聯(lián)。超聲引導(dǎo)下甲狀腺細(xì)針穿刺技術(shù)及三維容積測量技術(shù)可以在GD患者131I治療中發(fā)揮重要作用。