肝臟血管認(rèn)知更新與研究新思路

林 媛，劉志敏，董夢琦，周偉杰

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 510515

肝臟是哺乳動(dòng)物身體最大的器官，具有高度多樣復(fù)雜的功能。肝臟組織的一個(gè)基本特征是其獨(dú)特的血管模式。兩條傳入血管向肝臟供血：門靜脈和肝動(dòng)脈。門靜脈血來自胃、腸、胰腺和脾臟，低氧低壓力，富含從消化道吸收的營養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)以及內(nèi)臟產(chǎn)生的激素和生長因子。動(dòng)脈血具有系統(tǒng)水平的氧氣、壓力和成分。肝臟血液傳出系統(tǒng)為肝靜脈或“中央”靜脈，通過下腔靜脈到達(dá)全身循環(huán)。肝血竇形成一個(gè)非常特殊的血管系統(tǒng)，介于傳入和傳出血管之間，其由有孔的內(nèi)皮細(xì)胞單層排列組成，缺乏結(jié)構(gòu)化的基底膜，提供了血液和肝細(xì)胞之間特別有效的溝通［1-3］。最廣泛研究和分析的肝臟形態(tài)和功能單位是肝小葉（經(jīng)典的基爾南氏），在二維組織切片上呈多邊形（通常為六邊形）。如圖1所示，肝小葉多邊形角部被小葉間膽管、門靜脈和肝動(dòng)脈的終支組成的“門脈三聯(lián)體”占據(jù)，肝靜脈的終支（中央靜脈）位于小葉的中心，血液沿向心方向從門脈經(jīng)肝血竇流向中央靜脈。竇狀細(xì)胞與相鄰肝板中的肝細(xì)胞之間存在一個(gè)狹窄的裂縫，稱為Disse間隙。肝細(xì)胞產(chǎn)生的膽汁在相鄰肝細(xì)胞形成的膽管中以離心方向流動(dòng)，并由門三聯(lián)體的小葉間膽管收集。

圖1 肝小葉微血管分布示意圖Fig.1 Distribution of microvessels in the hepatic lobule.The liver consists of numerous anatomical units called lobules.In each hepatic lobule,blood flows from the portal vein and the hepatic artery through the liver sinusoid toward the central vein.

盡管對門脈、肝血竇、中央靜脈的血管分布認(rèn)識已經(jīng)非常清楚，但在肝臟病理變化中，除了肝血竇毛細(xì)血管化被特別關(guān)注，很少研究關(guān)注門脈與中央靜脈的變化與功能。本綜述將總結(jié)肝血管系統(tǒng)在慢性肝病中的研究進(jìn)展，重點(diǎn)關(guān)注并討論門脈、肝血竇、中央靜脈三者的不同變化與功能。未來對這三種血管功能與調(diào)控機(jī)制的清晰解析將可能帶來肝臟發(fā)育、再生及疾病調(diào)控領(lǐng)域的重大突破。

1 肝血竇毛細(xì)血管化與肝纖維化

肝纖維化是肝臟損傷修復(fù)過程中的瘢痕形成過程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，逐步發(fā)展為肝硬化乃至肝癌，導(dǎo)致機(jī)體死亡［4］。無論何種病因引起的慢性肝病，均以炎癥和進(jìn)行性纖維化為特征。肝臟特殊的微血管系統(tǒng)肝血竇缺乏基膜，由單層肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）圍成管腔。LSECs上分布孔徑大小為100～150 nm約占其表面積20%的穿孔，在血液和實(shí)質(zhì)組織之間提供大分子和微顆粒的開放通道［5］。研究者很早就注意到，肝纖維化進(jìn)展中伴隨著LSECs開窗減少并在肝血竇管腔外側(cè)出現(xiàn)有組織的基底層，這一過程稱為肝血竇毛細(xì)血管化。大部分觀念認(rèn)為肝血竇毛細(xì)血管化是肝纖維化進(jìn)展的繼發(fā)效應(yīng)和表型特征之一，即肝纖維化會促進(jìn)肝血竇毛細(xì)血管化現(xiàn)象發(fā)生，同時(shí)肝血竇毛細(xì)血管化又會加重肝纖維化進(jìn)程［6］。也有研究認(rèn)為肝血竇毛細(xì)血管化先于肝纖維化的發(fā)生，是肝纖維化進(jìn)展的看門人事件［7］。肝星狀細(xì)胞激活一直被認(rèn)為肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，其可通過細(xì)胞外基質(zhì)、炎性細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激的變化而促進(jìn)肝血竇毛細(xì)血管化［8］。反過來，LSECs也可調(diào)控肝星狀細(xì)胞的活化，正常分化的LSECs可阻止肝星狀細(xì)胞激活并促進(jìn)其恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài)，而毛細(xì)血管化的LSECs則會促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化［9］。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校窝]去毛細(xì)血管化促進(jìn)了輕度纖維化的消退［9,10］。

2 血管新生與肝纖維化

血管新生指從現(xiàn)有血管系統(tǒng)生成新血管，在各組織器官發(fā)育和損傷修復(fù)中均有發(fā)生，主要依賴多種生長因子和缺氧誘導(dǎo)［11］。血管結(jié)構(gòu)紊亂是肝纖維化/肝硬化的重要病理特征，病理性血管新生在慢性肝病中被廣泛描述，新血管的形成與不同慢性肝病典型的纖維化發(fā)展模式密切相關(guān)，最終導(dǎo)致肝硬化特有的異常血管結(jié)構(gòu)［12-15］。研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化進(jìn)展中，血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子1、成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子、血管生成素I、肝特異性血管生成因子ANGPTL3、VEGF受體I型（Flt-1）和II型（Flk-1）以及血管生成素I受體Tie-2、整合素、Ephrin和其他多種參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑和血管生成的粘附分子的基因表達(dá)增加［16,17］。這表明血管新生在肝纖維化進(jìn)程中被多維度調(diào)控，并且可能是促進(jìn)纖維化發(fā)生的必要步驟。一些實(shí)驗(yàn)室證據(jù)表明，抑制血管生成可以抑制肝纖維化進(jìn)展［18-22］，然而也有證據(jù)表明，抑制血管生成會加重纖維化，促進(jìn)血管生成反而會促進(jìn)纖維化消融［23-25］。這些矛盾的報(bào)道很難得到合理解釋，使得血管新生在肝纖維化中的作用變得撲朔迷離，靶向血管治療肝纖維化因此陷入困境。究其原因，是因?yàn)楦卫w維化中血管新生的相關(guān)研究比較粗糙，僅僅從整體組織觀察血管的染色深淺和數(shù)量多少，缺少對血管新生的具體位置特征和來源的深入研究，無法區(qū)分這些“新生”血管哪些來源于門脈和中央靜脈，哪些來源于肝血竇毛細(xì)血管化，哪些來源于骨髓前體血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些不同位置和來源的血管是否扮演不同的角色完全不清楚。

3 肝纖維化進(jìn)程中的門脈與中央靜脈的變化

一直以來，在慢性肝病進(jìn)程中門脈血管和中央靜脈血管的變化與功能缺乏關(guān)注。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化進(jìn)程中，除了已被廣泛報(bào)道的肝血竇發(fā)生毛細(xì)血管化，一直被忽略的匯管區(qū)血管和中央靜脈區(qū)血管也發(fā)生了不同變化，其中匯管區(qū)血管變少，中央靜脈區(qū)血管增多（圖2）［26］。這些變化發(fā)生在病變的非常早期，并持續(xù)加強(qiáng)。利用谷氨酰胺合成酶（GS）來標(biāo)記肝小葉中央?yún)^(qū)可發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型中，GS陽性區(qū)在第1天即開始擴(kuò)張，第4天出現(xiàn)相鄰GS區(qū)連接在一起現(xiàn)象，提示此時(shí)便已發(fā)生了中央?yún)^(qū)橋接。相應(yīng)的，中央?yún)^(qū)血管增多和肝血竇毛細(xì)血管化發(fā)生在第1天，匯管區(qū)血管減少則發(fā)生在第4天。膠原天狼星紅染色顯示膠原累積發(fā)生在第4天。在膽堿缺乏的高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝模型中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。在第3周肝纖維化非常輕微的時(shí)候，匯管區(qū)血管減少、血竇毛細(xì)血管化和中央?yún)^(qū)血管增多均已發(fā)生。這表明，肝臟不同位置的血管均在肝纖維化中發(fā)揮非常重要的作用。從肝臟功能和結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常化的角度可以推導(dǎo)出直接而樸素的觀點(diǎn)：匯管區(qū)血管增多抑制肝纖維化，肝血竇毛細(xì)血管化增多促進(jìn)肝纖維化，中央靜脈區(qū)血管增多促進(jìn)肝纖維化。當(dāng)然，目前支持這個(gè)推論的證據(jù)尚不充分。需要合適的譜系示蹤小鼠能夠分別特異性標(biāo)記門脈血管、肝血竇、中央靜脈血管，給出三者在肝纖維化進(jìn)程中準(zhǔn)確的數(shù)量和位置變化。這在目前難以做到，因?yàn)槿狈δ軌蛑苯訁^(qū)分3種血管的標(biāo)志物。更重要的是要明確匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)血管調(diào)控的不同機(jī)制，二者結(jié)構(gòu)相似，變化卻相反，其內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制解析將可能給出特異性調(diào)控其中一種血管的方法，為闡明二者的功能闡明提供直接證據(jù)。

圖2 肝纖維化不同血管發(fā)生不同變化示意圖Fig.2 Schematic illustration of different changes in different blood vessels during fibrogenesis.During liver fibrogenesis,the portal vessels decrease,sinusoid capillarization increases,and the central vessels increase.The increase of portal vessels alleviates liver fibrosis;the increase of central vessels and the increase of sinusoid capillarization aggravates liver fibrosis.LECT2/Tie1 signaling decreases portal vessels,increases sinusoid capillarization,and increase central vessels.VEGF/VEGFR signaling increases portal vessels,increases sinusoid capillarization,and increases central vessels.The combination treatment of AAV9-LECT2-shRNA and bevacizumab significantly improves the therapeutic effects on liver fibrosis.CV:Central vein;PV:Portal vein.

4 一條新的血管調(diào)控通路：LECT2/Tie1信號

Tie（tyrosine kinase with immunoglobulin-like and epidermal growth factor homology）家族酪氨酸激酶受體Tie1與Tie2是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的一次跨膜受體，二者可形成異源二聚體，在血管新生和穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用［27,28］。其中Tie2的功能和機(jī)制研究的比較成熟，血管生成素蛋白家族成員Ang1、Ang2、Ang4等都可與Tie2結(jié)合調(diào)控血管新生和穩(wěn)態(tài)維持，在發(fā)育和多種疾病中扮演重要角色［29-31］。Tie1被報(bào)道與Tie2結(jié)合參與Ang-Tie2信號通路調(diào)控，它本身則不與任何血管生成素蛋白家族成員直接結(jié)合［32,33］。Tie1的功能非常重要，其基因敲除小鼠會導(dǎo)致中晚期胚胎發(fā)育因嚴(yán)重的出血和微血管異常而致死，但它的配體一直未被找到，二十多年來一直作為孤兒受體（orphan receptor）存在，其下游調(diào)控機(jī)制也不清楚［34-36］。我們最新研究發(fā)現(xiàn)，肝臟受損時(shí)，分泌型蛋白LECT2在血管周圍肝細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞孤兒受體Tie1直接結(jié)合，促進(jìn)Tie1/Tie2異源二聚體解離，誘導(dǎo)Tie2/Tie2同源二聚體增多，磷酸化增強(qiáng)，激活下游MAPK/PPAR信號通路，抑制蛋白酶MMPs表達(dá)，促進(jìn)胞外基質(zhì)蛋白分泌，上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘連蛋白VE-cadherin，抑制匯管區(qū)新生，促進(jìn)肝血竇毛細(xì)血管化，促進(jìn)匯管區(qū)血管新生，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程［37］。令人吃驚的是，與VEGF/VEGFR信號同時(shí)促進(jìn)匯管區(qū)和中央?yún)^(qū)血管新生增多不同，LECT2/Tie1信號抑制匯管區(qū)血管新生，促進(jìn)中央?yún)^(qū)血管新生（圖2）［26］。運(yùn)用腺相關(guān)病毒攜帶Lect2-shRNA（AAV-Lect2-shRNA)阻斷LECT2/Tie1信號可顯著抑制小鼠肝纖維化，表明LECT2/Tie1信號是治療肝纖維化的重要靶點(diǎn)［26,37］。此外，作為新的血管調(diào)控通路，LECT2/Tie1信號在其他組織器官損傷修復(fù)中是否發(fā)揮重要調(diào)控作用值得廣泛和深入研究。

5 靶向血管治療肝纖維化策略準(zhǔn)則

既然肝小葉匯管區(qū)、肝血竇、中央?yún)^(qū)的血管在肝纖維化中發(fā)生了不同變化，那么簡單地抑制或促進(jìn)血管新生顯然不能提供理想的血管修正。這可以解釋上文提到的血管抑制劑或激活劑既可以抑制肝纖維化又可以促進(jìn)肝纖維化的矛盾報(bào)道。比如，血管抑制劑抑制了肝血竇毛細(xì)血管化和中央靜脈對抑制肝纖維化是有利的，然而它抑制了匯管區(qū)血管新生則促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展；反過來血管激活劑促進(jìn)了匯管區(qū)血管新生和肝血竇去毛細(xì)血管化對抑制肝纖維化是有利的，但它促進(jìn)中央?yún)^(qū)血管新生則促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。藥物最終的表現(xiàn)取決于因給藥時(shí)機(jī)和劑量差異引起的三種血管不同的平衡偏向而不同。因此，針對靶向血管調(diào)控治療肝纖維化，我們可以提出這樣的準(zhǔn)則：需同時(shí)滿足促進(jìn)匯管區(qū)血管新生，抑制肝血竇毛細(xì)血管化和抑制中央?yún)^(qū)血管新生，使血管正?；：茱@然，單一的血管調(diào)節(jié)通路不足以同時(shí)滿足血管新生的促進(jìn)、抑制及血管重構(gòu)的綜合調(diào)控，需要多條血管調(diào)控通路在時(shí)間和空間上進(jìn)行合理搭配才能達(dá)到理想要求。我們初步聯(lián)合調(diào)控新發(fā)現(xiàn)的LECT2/Tie1信號和已廣泛研究的VEGF/VEGFR信號通路來驗(yàn)證這個(gè)概念。發(fā)現(xiàn)LECT2/Tie1信號抑制劑AAV-Lect2-shRNA、VEGF/VEGFR 信號貝伐單抗（Bevacumab）、VEGF/VEGFR信號激活劑VEGF重組蛋白（rVEGF）均能一定程度抑制小鼠肝纖維化，其中AAV-Lect2-shRNA聯(lián)合貝伐單抗和AAV-Lect2-shRNA聯(lián)合VEGF重組蛋白大大提高了肝纖維化的治療效果。鑒于AAV-Lect2-shRNA 聯(lián)合VEGF 重組蛋白出現(xiàn)了較嚴(yán)重副作用，AAV-Lect2-shRNA聯(lián)合貝伐單抗成為治療肝纖維化的可推薦方法（圖2）。在該治療策略下，可觀察到匯管區(qū)血管新生增加，肝血竇毛細(xì)血管化減少，中央?yún)^(qū)血管新生減少，符合靶向血管治療準(zhǔn)則，使肝臟血管正?；?。進(jìn)一步在時(shí)間和空間上組合多條血管調(diào)控通路以達(dá)到對3種血管進(jìn)行理想調(diào)控是該治療準(zhǔn)則指導(dǎo)下的正確研究方向，而對3種血管精準(zhǔn)調(diào)控機(jī)制的解析無疑將推進(jìn)該準(zhǔn)則的驗(yàn)證與實(shí)施。

6 總結(jié)與展望

肝臟病變中的血管變化是一個(gè)多年來比較沉寂的研究領(lǐng)域，但現(xiàn)在可以被重新激活。肝臟3種不同位置的3種微血管的不同變化、不同功能、不同調(diào)控機(jī)制蘊(yùn)含著豐富的重要信息，很多新的問題有待解決。比如，除了慢性肝病，在肝臟發(fā)育和肝臟切除再生中，3種血管的變化規(guī)律和功能是什么？匯管區(qū)除了靜脈，還有動(dòng)脈和膽管，它們的變化規(guī)律和功能是什么？作為結(jié)構(gòu)和功能相似的門靜脈和中央靜脈為什么變化不一致？其調(diào)控機(jī)制是什么？LECT2/Tie1信號對門靜脈和中央靜脈的調(diào)控方向相反，其原因是什么？肝纖維化/肝硬化中的血管來源（門脈、中央靜脈、肝血竇、骨髓前體血管內(nèi)皮細(xì)胞）的比例、位置分布規(guī)律和作用是什么？如何對它們進(jìn)行分別調(diào)控？只有清楚解決這些問題，才有可能在時(shí)間和空間上精準(zhǔn)調(diào)控這些異常的血管，使之正?；?，達(dá)到最好的肝病治療效果。從肝臟引申開來，其他組織器官，比如肺臟、腎臟、大腦等也擁有極具特色的微血管系統(tǒng)，從血管精準(zhǔn)調(diào)控的角度來開展研究，而不是簡單寬泛地促進(jìn)或抑制血管新生，將有可能發(fā)現(xiàn)新的重要調(diào)控機(jī)制和干預(yù)策略。