PCR-核酸試紙條快速鑒定皮氏羅爾斯頓菌

王 丹，趙瀟穎，姜菲菲，孫麗穎，許 萌，宿建勝，趙云冬

北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013

制藥用水是藥品生產(chǎn)中最重要的原料，制藥用水的質(zhì)量直接影響藥品的質(zhì)量，尤其是滅菌的注射用水。滅菌的注射用水常用于滅菌粉末的溶劑或注射劑的稀釋劑，直接注射到人體組織中，關(guān)乎患者的生命安全［1］。2015年《中華人民共和國(guó)藥典》明確規(guī)定滅菌注射用水為注射用水按照注射劑生產(chǎn)工藝制備所得，不含任何添加劑，屬無(wú)菌狀態(tài)［2］。2010年《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》明確指出純化水、注射用水的制備、貯存和分配是防止微生物的滋生的關(guān)鍵［3］。隨著新版GMP的實(shí)施，各制藥企業(yè)對(duì)制藥用水風(fēng)險(xiǎn)控制更加關(guān)注，特別是水中微生物尤為重要。

皮氏羅爾斯頓菌是一種非發(fā)酵的革蘭氏陰性桿菌，容易吸附在水系統(tǒng)的運(yùn)輸管道和儲(chǔ)存罐中，大量繁殖并形成生物膜［4］，且菌體較小可以通過(guò)0.02 μm過(guò)濾器，從而污染溶液，包括無(wú)菌注射用水、用純凈水制成的鹽溶液、無(wú)菌藥物溶液、沖洗液等［5-8］，引發(fā)嚴(yán)重的醫(yī)療事故。因此尋找快速、準(zhǔn)確的鑒定方法，對(duì)于制藥企業(yè)對(duì)制藥用水中皮氏羅爾斯頓菌的控制十分必要。

目前針對(duì)制藥用水污染微生物的鑒定包括傳統(tǒng)分離鑒定法、免疫學(xué)檢測(cè)方法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法等［9］。傳統(tǒng)微生物學(xué)方法中，皮氏羅爾斯頓菌生長(zhǎng)緩慢，常需要培養(yǎng)72 h才可見圓形、凸起、透明小菌落，生化鑒定試驗(yàn)步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)。分子生物學(xué)方法中，對(duì)皮氏羅爾斯頓菌的鑒定主要是利用普通PCR技術(shù)，其它方法目前尚無(wú)報(bào)道。普通PCR技術(shù)操作復(fù)雜，特別是結(jié)果觀察所采用的瓊脂糖凝膠電泳法，需要耗時(shí)近60 min，大大增加了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作時(shí)長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用PCR技術(shù)結(jié)合膠體金試紙條，只需要將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到膠體金試紙條上，從而實(shí)現(xiàn)5 min快速可視化結(jié)果觀察，擺脫了瓊脂糖凝膠電泳耗時(shí)較長(zhǎng)的步驟，具有簡(jiǎn)單快速，成本較低的優(yōu)點(diǎn)［10］，更適合制藥企業(yè)對(duì)污染菌的快速鑒定。本團(tuán)隊(duì)2021年對(duì)遼寧某生物科技有限公司制藥用水采樣，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物擴(kuò)增并測(cè)序，同一批污染菌標(biāo)本鑒定出7株皮氏羅爾斯頓菌，以此對(duì)皮氏羅爾斯頓菌建立PCR-核酸試紙條快速檢測(cè)方法并對(duì)此次污染進(jìn)行溯源分析。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)自制藥企業(yè)制藥用水中分離，采用細(xì)菌通用引物（上游引物27F：5'AGTTTGATCMTGG CTCAG3'；下游引物1492R：5'GGTTACCTTGTTA CGACTT3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定所得菌株。

1.2 試劑

LB培養(yǎng)基（OXOID）、磁珠保存管（青島海博生物技術(shù)有限公司）、M-100 bp DNA Ladder、Taq PCR MasterMix（2X）（北京天根生化科技有限公司）、引物（上海生工生物有限公司）、生物素化牛血清白蛋白BSA-Biotin（北京達(dá)博諾科技有限公司）、鏈霉親和素（北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司）、兔抗FITC多克隆抗體（上海生工生物有限公司）、膠體金（上海易澤生物科技有限公司）、牛血清白蛋白（上海碧云天）、試紙條快速診斷整合方案（上海杰一生物技術(shù)有限公司）、其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

Thermo Fisher 高速離心機(jī)（Thermo）、NanoDrop One 微量核酸蛋白測(cè)定儀（Quawell）、金屬?。坡飞鰷u混勻器（賽洛捷克）、多功能梯度PCR儀（東勝）、紫外凝膠成像分析儀（上海顧村電光儀器廠）、電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司）、YXQ-LS-75S11立式蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.4 煮沸法提取基因組

將制藥用水污染菌樣本進(jìn)行編號(hào)，按編號(hào)分別進(jìn)行分離培養(yǎng)，取分離培養(yǎng)后的實(shí)驗(yàn)菌株，用接種環(huán)取一環(huán)細(xì)菌于裝有100 μL ddH2O的無(wú)菌離心管中，貼壁研磨至渾濁懸液。震蕩混勻，將離心管放置金屬浴中，100 ℃加熱10 min，12 000×g水平離心10 min，棄沉淀，上清液為基因組DNA。

1.5 引物設(shè)計(jì)并標(biāo)記

在NCBI上下載皮氏羅爾斯頓菌16S rDNA基因保守序列，通過(guò)DNAMAN比對(duì)分析，使用NCBI primer-BLAST 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物Ral-131，片段長(zhǎng)度為131 bp（表1）。分別在引物的5’端標(biāo)各標(biāo)記異硫氰酸熒光素（FITC）與生物素（Biotin），由大連寶生物工程（大連）有限公司完成。

表1 皮氏羅爾斯頓菌特異性引物序列Table 1 Sequences of primers specific for Ralstonia pickettii

1.6 PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)體系：PCR Master Mix（2×）12.5 μL，DNA模板（10 ng/μL）1 μL，特異性引物F、R（10 ng/μL）各0.5 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min，4 ℃低溫保存。微量移液器取6 μL PCR產(chǎn)物加樣于1.2%的瓊脂糖凝膠中，85 V電泳50 min，紫外凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

1.7 PCR產(chǎn)物克隆及測(cè)序、比對(duì)

將皮氏羅爾斯頓菌特異性DNA片段進(jìn)行凝膠回收、純化，測(cè)量回收DNA濃度；使用pGM-T連接試劑盒將回收產(chǎn)物DNA與pGM-T載體連接，連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選陽(yáng)性克??；制備LB液體培養(yǎng)基增菌，進(jìn)行16 h搖菌過(guò)夜；質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證，分析比對(duì)結(jié)果。

1.8 PCR-核酸試紙條設(shè)計(jì)原理

以PCR 產(chǎn)物為檢測(cè)樣品，將8 μL PCR 產(chǎn)物與100 μL樣品展開液混合，加入到試紙條的樣品區(qū)，混合液由于毛細(xì)作用向前流動(dòng)，當(dāng)存在擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物5’端標(biāo)記的生物素首先與膠體金修飾的鏈霉親和素相結(jié)合，液相到達(dá)檢測(cè)線（T線）后，檢測(cè)線上標(biāo)記的兔抗FITC抗體會(huì)捕獲擴(kuò)增產(chǎn)物另一端修飾的異硫氰酸熒光素，形成復(fù)合物，從而使檢測(cè)線顯色。多余的膠體金顆粒會(huì)與質(zhì)控線（C線）上的生物素化的牛血清白蛋白結(jié)合，使質(zhì)控線顯色。當(dāng)不存在擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，T線上兔抗FITC抗體無(wú)法捕獲到異硫氰酸熒光素，所以檢測(cè)線不顯色，而過(guò)量的膠體金修飾的鏈霉親和素會(huì)與C線上的生物素化的牛血清白蛋白結(jié)合而顯色（圖1）。

圖1 膠體金核酸試紙條原理［11］Fig.1 Working mechanism of colloidal gold nucleic acid test strip[11].S: Sample area;T:Test line;C:Control line;AU:Colloidal aurum particle;SA:Streptavidin;B:Biotin;F:Fluorescein;Anti-F:Anti-fluorescein;BSA:Bovine serum albumin.

1.9 膠體金標(biāo)記鏈霉親和素最佳標(biāo)記量的確定

將制得的膠體金用0.1 mol/L碳酸鉀溶液調(diào)整pH值為7.0，分別取膠體金100μL于1.5 mL無(wú)菌EP管中。每個(gè)EP管中加入濃度為1 mg/mL待標(biāo)記的鏈霉親和素分別為2、2.5、3、3.5、4μL，震蕩混勻10 min，對(duì)照管則不加，在膠體金鏈霉親和素混合溶液中按0.5 mg/mL加入牛血清白蛋白，室溫混合20 min后，將混合液12 000×g水平離心20 min，留取沉淀，將上清液繼續(xù)按照上述方法離心，直至溶液無(wú)色，將沉淀懸浮于1/20～1/10初始膠體金體積的金膠緩沖液中懸浮使用，或于4 ℃保存［12-13］。以此確定鏈霉親和素的最佳標(biāo)記量。

1.10 抗體濃度的確定

將生物素化牛血清白蛋白和兔抗異硫氰酸熒光素抗體用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行0.8、1.2、1.6、2 mg·mL-1稀釋后分別劃于硝酸纖維素膜上，形成質(zhì)控線與檢測(cè)線，37 ℃烘干，檢測(cè)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，根據(jù)顯色結(jié)果確定兩者的工作濃度。

1.11 試紙條的組裝與檢測(cè)

各部分按照相應(yīng)的尺寸進(jìn)行裁剪，將裁剪好的PVC底板、樣品墊、制備完成的膠體金墊、標(biāo)記好質(zhì)控線與檢測(cè)線的硝酸纖維素膜、吸水墊，按此順序進(jìn)行組裝。用PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物8μL和樣品展開液100μL混合后加入樣品墊上，5 min后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：僅當(dāng)C、T 線同時(shí)出現(xiàn)紅色條帶為陽(yáng)性結(jié)果；C線出現(xiàn)紅色條帶，T線沒(méi)有出現(xiàn)紅色條帶為陰性；其他結(jié)果均為無(wú)效結(jié)果。

1.12 PCR-核酸試紙條原理的驗(yàn)證

核酸試紙條原理驗(yàn)證：將標(biāo)記的引物和未標(biāo)記的引物混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)。具體方法：第1組為上下游均標(biāo)記的引物；第2組為上游引物5’端標(biāo)記的異硫氰酸熒光素與下游未標(biāo)記的引物；第3組為上游未標(biāo)記的引物與下游5’端標(biāo)記的生物素的引物；第4組為均未標(biāo)記的引物；預(yù)期僅有第1組結(jié)果顯色。

1.13 PCR-核酸試紙條特異性評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)室對(duì)制藥企業(yè)制藥用水分離鑒定得到的不動(dòng)桿菌，氣單胞菌，假單胞菌、非脫羧勒克氏菌按照煮沸法提取基因組DNA，并稀釋至10 ng/μL模板，進(jìn)行核酸試紙條特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.14 PCR-核酸試紙條靈敏度評(píng)價(jià)

將皮氏羅爾斯頓菌DNA模板稀釋7個(gè)濃度梯度，分別為101ng·μL-1、100ng·μL-1、10-1ng·μL-1、10-2ng·μL-1、10-3ng·μL-1、10-4ng·μL-1、10-5ng·μL-1，每份基因組取1 μL，按照上述反應(yīng)進(jìn)行核酸試紙條靈敏度評(píng)價(jià)，并與1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.15 PCR-核酸試紙條穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

按照優(yōu)化的條件完成試紙條的組裝，試劑的配制并保存。分別在3、6、9、12月進(jìn)行核酸試紙條穩(wěn)定性驗(yàn)證。PCR反應(yīng)按照1.6節(jié)反應(yīng)條件進(jìn)行，并與1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.16 同源性分析并構(gòu)建進(jìn)化樹

對(duì)本次注射用水所采集不同來(lái)源的7株皮氏羅爾斯頓菌使用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將測(cè)序結(jié)果使用MEGA 7.0進(jìn)行16S rDNA基因序列同源性分析并對(duì)污染菌構(gòu)建進(jìn)化樹，以此對(duì)此次污染菌進(jìn)行溯源性分析。

2 結(jié)果

2.1 煮沸法提取基因組結(jié)果

使用NanoDrop One微量核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)基因組測(cè)定，7株皮氏羅爾斯頓菌的A260/A280比值均介于1.8～2.0，純度較好（表2）。經(jīng)濃度0.8%瓊脂糖凝膠DNA原液電泳結(jié)果顯示，各泳道條帶清晰明亮，此方法提取的基因組相對(duì)完整，符合PCR反應(yīng)的要求。相比而言，試劑盒法提取基因組步驟較繁瑣，耗時(shí)約90 min，而煮沸法整個(gè)過(guò)程僅需30 min。

表2 皮氏羅爾斯頓菌DNA濃度、純度結(jié)果Table 2 DNAconcentration and purity results of Ralstonia pickettii

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用特異性引物對(duì)制藥用水分離鑒定的7株皮氏羅爾斯頓菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取6 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果7株羅爾斯頓菌均在131 bp處有明亮單一條帶（圖2）。

圖2 PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.2 PCR amplification electrophoresis results.M-100 bp DNA ladder;Lanes 1-7: Ralstonia pickettii;N:Blank control.

2.3 PCR產(chǎn)物克隆及測(cè)序、比對(duì)結(jié)果

試劑盒提取質(zhì)粒DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：1、2泳道可見明亮清晰的目的條帶（圖3），證明目的基因成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒。PCR產(chǎn)物克隆后，測(cè)序分析結(jié)果顯示（圖4）：經(jīng)NCBI-BLAST比對(duì)，所測(cè)皮氏羅爾斯頓菌序列與GenBank中已登記的皮氏羅爾斯頓菌相似性為100%，證明所克隆片段為目的基因片段，可以作為陽(yáng)性質(zhì)粒。

圖3 克隆目的基因片段電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of cloned target gene fragment.M: 100 bp DNA ladder;Lanes 1,2: Cloning target fragment of 1-2-Ralstonia pickettii;N:Blank control.

圖4 皮氏羅爾斯頓菌目的基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 Sequence alignment results of target genes of Ralstonia pickettii.

2.4 膠體金標(biāo)記鏈霉親和素的最佳標(biāo)記量的確定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，1 mg/mL鏈霉親和素的最適添加量為3.5 μL時(shí)，檢測(cè)產(chǎn)物時(shí)顯色度最好，顏色介于紫色和粉紅色之間（圖5），所以在后期組裝試紙條時(shí)按3.5 μg進(jìn)行標(biāo)記。

圖5 膠體金標(biāo)記鏈霉親和素的最佳標(biāo)記量結(jié)果Fig.5 The optimal labeling amount of colloidal gold-labeled streptavidin.1:2μL,2:2.5μL,3:3μL,4:3.5μL,5:4.0μL.

2.5 抗體濃度的確定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，C線的生物素化牛血清白蛋白的最佳濃度為1.2 mg/mL時(shí)條帶較清晰（圖6）。T線上兔抗異硫氰酸熒光素最佳抗體濃度為2 mg/mL時(shí)，與陽(yáng)性PCR產(chǎn)物反應(yīng)，產(chǎn)生較為清晰的條帶（圖7）。

圖6 生物素化牛血清白蛋白的濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Concentration optimization results of biotinylated bovine serum albumin.1:0.8 mg·mL-1,2:1.2 mg·mL-1,3:1.6 mg·mL-1,4:2.0 mg·mL-1.

圖7 兔抗異硫氰酸熒光素最佳抗體濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Optimization results of rabbit optimal antibody concentration against fluorescein isothiocyanate.1:0.8 mg·mL-1,2:1.2 mg·mL-1,3:1.6 mg·mL-1,4:2.0 mg·mL-1.

2.6 核酸試紙條原理驗(yàn)證結(jié)果

本試驗(yàn)分別將5’端標(biāo)記的引物和未標(biāo)記的引物混合搭配后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。只有標(biāo)記引物的PCR 產(chǎn)物兩端會(huì)形成異硫氰酸熒光素-生物素復(fù)合物，此時(shí)核酸膠體金試紙條才會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)。在保證同一PCR產(chǎn)物時(shí)，只有1號(hào)核酸膠體金試紙條為陽(yáng)性結(jié)果（圖8）。核酸試紙條原理驗(yàn)證試驗(yàn)成功。

圖8 核酸試紙條原理驗(yàn)證結(jié)果Fig.8 Verification results of nucleic acid test strip principle.1:PCR products of both labeled upstream and downstream primers;2: PCR products of labeled upstream primers and unlabeled downstream primers;3: PCR products of unlabeled upstream primers and labeled downstream primers;4: Both upstream and downstream primers that are not labeled PCR product.

2.7 PCR-核酸試紙條特異性評(píng)價(jià)

對(duì)本次采樣的7株皮氏羅爾斯頓菌與實(shí)驗(yàn)室保存的制藥用水分離鑒定的不動(dòng)桿菌，氣單胞菌，假單胞菌、非脫羧勒克氏菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)特異性的評(píng)價(jià)。電泳結(jié)果顯示，7株不同來(lái)源的羅爾斯頓菌均在131 bp處擴(kuò)增出單一明亮目的片段，其它菌株未見條帶（圖9）。PCR-核酸試紙條的結(jié)果顯示，僅有皮氏羅爾斯頓菌為陽(yáng)性結(jié)果，其它菌株及空白對(duì)照只有質(zhì)控線的出現(xiàn)紅色條帶，為陰性結(jié)果（圖10）。PCR電泳結(jié)果與PCR-核酸試紙條結(jié)果一致。

圖9 引物特異性驗(yàn)證Fig.9 Primer specificity verification.M-100 bp DNA ladder;1-7: Ralstonia pickettii;8: Leclercia adecarboxylata;9:Acinetobacter calcoaceticus;10: Pseudomonas;11: Aeromonas;N-blank control.

圖10 核酸試紙條特異性驗(yàn)證Fig.10 Specificity verification of nucleic acid test strip.1-7:Ralstonia pickettii;8:Leclercia adecarboxylata;9:Acinetobacter calcoaceticus;10:Pseudomonas;11:Aeromonas;N:blank control.

2.8 PCR-核酸試紙條靈敏度評(píng)價(jià)

采用無(wú)菌ddH2O將皮氏羅爾斯頓菌DNA模板稀釋7個(gè)濃度梯度，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行靈敏度評(píng)價(jià)。電泳結(jié)果顯示，在10-2ng·μL-1時(shí)仍可見較淺目的條帶，證明引物靈敏度良好，最低檢測(cè)限為10-2ng·μL-1（圖11）。PCR-核酸試紙條的結(jié)果顯示，在稀釋到10-5ng·μL-1仍可見C線和T線同時(shí)出現(xiàn)兩條清晰的紅色條帶，為陽(yáng)性結(jié)果，所以試紙條的最低檢測(cè)限為10-5ng·μL-1（圖12）。PCR-核酸試紙條的靈敏度較普通PCR靈敏性高1000倍。

圖11 引物靈敏度驗(yàn)證Fig.11 Primer sensitivity test.M:100 bp DNA Ladder;1:101 ng·μL-1;2:100 ng·μL-1;3:10-1 ng·μL-1;4:10-2 ng·μL-1;5:10-3 ng·μL-1;6:10-4 ng·μL-1;7:10-5 ng·μL-1;N:Blank control.

圖12 核酸試紙條靈敏度驗(yàn)證Fig.12 Sensitivity test of nucleic acid test strip.M:100 bp DNALadder;1:101 ng·μL-1;2:100 ng·μL-1;3:10-1 ng·μL-1;4:10-2ng·μL-1;5:10-3 ng·μL-1;6:10-4 ng·μL-1;7:10-5 ng·μL-1;8:10-6 ng·μL-1;N:Blank control.

2.9 PCR-核酸試紙條穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

按照優(yōu)化的反應(yīng)條件組裝核酸試紙條，將保存的核酸試紙條在第3、6、9、12月取出進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與陽(yáng)性對(duì)照相比較，陽(yáng)性PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果一致，只有皮氏羅爾斯頓菌出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果即C線、T線都出現(xiàn)紅色條帶，空白對(duì)照為陰性結(jié)果即只C線出現(xiàn)1條紅色條帶（圖13）。

圖13 試紙條3、6、9、12月穩(wěn)定性驗(yàn)證Fig.13 Stability verification of test strip at 3(A),6(B),9(C)and 12 months(D).1:Positive control of Ralstonia pickettii;2:Ralstonia pickettii;3:Blank control.

2.10 構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行溯源性分析結(jié)果

對(duì)此次注射用水采集鑒定的7株皮氏羅爾斯頓菌，分別來(lái)自純化水區(qū)、注射用水區(qū)、細(xì)胞反應(yīng)器與不同規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)基，使用MEGA 7.0進(jìn)行16Sr DNA基因序列同源性分析并對(duì)污染菌構(gòu)建進(jìn)化樹（圖14）。根據(jù)發(fā)育樹值顯示，純化水區(qū)、注射用水區(qū)、細(xì)胞培養(yǎng)基與細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器菌株親緣關(guān)系較近，考慮存在交叉污染，應(yīng)對(duì)制藥用水區(qū)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

圖14 7株皮氏羅爾斯頓菌16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.14 Phylogenetic tree of 16S rDNA construction of 7 strains of Ralstonia pickettii.R1: Purified water area;R2:Injection water area;R3: 300 L bacterial culture medium;R4: 200 L bacterial culture medium;R5: 200 L bacterial culture medium;R6:300 L bacterial culture medium;R7:Medium reactor.

3 討論

皮氏羅爾斯頓菌曾被認(rèn)為是一種毒性很低，常常被忽略的致病菌，但在醫(yī)院環(huán)境中，它們已被證明會(huì)引起嚴(yán)重的醫(yī)院感染［14-19］，如腦膜炎、肺炎、血流感染等。同時(shí)在治療方面這種細(xì)菌是很頑固的，它對(duì)多種不同類型的抗生素產(chǎn)生耐藥性［20］。因此建立快速鑒定制藥用水中皮氏羅爾斯頓菌的方法，保障用藥安全尤為重要。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用PCR技術(shù)鑒定微生物的方法逐漸成熟且多元化。有研究針對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)注射劑生產(chǎn)企業(yè)的制藥用水系統(tǒng)建立微生物菌庫(kù)，純化水系統(tǒng)和注射用水系統(tǒng)中通過(guò)PCR擴(kuò)增及測(cè)序技術(shù)鑒定出多株羅爾斯頓菌［21］，但沒(méi)有針對(duì)這類常見污染菌建立快速檢測(cè)的方法。Ryan 等［22］使用多重PCR 技術(shù)、RAPD-PCR和BOX-PCR技術(shù)對(duì)皮氏羅爾斯頓菌進(jìn)行鑒定，但此方法需要操作人員具有一定的專業(yè)知識(shí)，步驟繁瑣，使用瓊脂糖凝膠電泳法觀察結(jié)果，耗時(shí)較長(zhǎng)。而相比PCR-核酸試紙條技術(shù)就無(wú)須耗時(shí)較長(zhǎng)的電泳技術(shù)，它基于PCR技術(shù)設(shè)計(jì)特異性引物，并將引物進(jìn)行雙標(biāo)記，充分體現(xiàn)了PCR技術(shù)的高靈敏度與特異性，產(chǎn)物中的FITC與膠體金試紙條上相對(duì)應(yīng)的抗體結(jié)合形成檢測(cè)線，生物素-膠體金修飾的鏈霉親和素與生物素化的牛血清白蛋白特異性結(jié)合形成質(zhì)控線，整體反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，既可以使得整個(gè)鑒定過(guò)程可在2 h內(nèi)完成，又可以避免生物素過(guò)飽和而導(dǎo)致的陽(yáng)性產(chǎn)物漏檢情況的發(fā)生。這種可靠的檢測(cè)技術(shù)可以為質(zhì)檢人員提供現(xiàn)場(chǎng)快速且操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)手段，大大縮短污染菌的鑒定周期。在節(jié)約成本方面，核酸膠體金試紙條相比免疫膠體金試紙條可以在購(gòu)買昂貴抗體方面減少資金花費(fèi)，從而降低膠體金試紙條的成本，更適合基層制藥企業(yè)使用。

本實(shí)驗(yàn)以制藥用水中分離得到的7株皮氏羅爾斯頓菌為研究對(duì)象，將PCR技術(shù)與膠體金免疫層析法相結(jié)合，建立PCR-核酸試紙條技術(shù)快速檢測(cè)皮氏羅爾斯頓菌。因煮沸法較試劑盒法提取基因組在耗時(shí)上更有優(yōu)勢(shì)，且利用煮沸法提取基因組DNA，濃度、純度較好、操作簡(jiǎn)單、可快速獲得，已通過(guò)克隆轉(zhuǎn)化得到陽(yáng)性對(duì)照。檢測(cè)時(shí)只需要將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物8 μL與100 μL樣品展開液混合后滴加到樣品墊上，5 min 后即可觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)特異性結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致，靈敏度較瓊脂糖凝膠電泳高1000倍，在試紙條3、6、9、12月分別檢測(cè)穩(wěn)定性，結(jié)果表明穩(wěn)定性較好，因此核酸試紙條技術(shù)也被應(yīng)用到其它多個(gè)領(lǐng)域［23-25］。本實(shí)驗(yàn)研制的核酸膠體金試紙條比起傳統(tǒng)微生物學(xué)方法、普通PCR技術(shù)與免疫膠體金技術(shù)等有一定的優(yōu)越性，但對(duì)于一些基層企業(yè)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有PCR儀等先進(jìn)儀器，不能做到及時(shí)且快速的檢測(cè)，為了解決這些問(wèn)題，更好的服務(wù)于基層企業(yè)，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)將考慮使用不需要復(fù)雜儀器即可完成反應(yīng)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，即LAMP［26］、RPA［27］及PSR［28］等技術(shù)，它們與試紙條技術(shù)相結(jié)合必將成為未來(lái)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的新方向，從而更好的為制藥企業(yè)建立快速檢測(cè)污染菌提供更多地技術(shù)支持。