MicroRNA-150通過下調MUC4抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲*

瑪依努爾·尼牙孜,伊力努爾·哈力甫,王 琳,韓莉莉,魯 靜,阿依米熱·艾山江,朱開春

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,烏魯木齊 830001)

宮頸癌是全球女性中第二大常見癌癥，是發(fā)展中國家女性癌癥死亡的主要原因[1]。高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險因素[2]，但病毒介導的癌變機制尚未完全了解[3]。microRNA(miRNA)作為細胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡和宿主-病毒相互作用等各種過程的重要調節(jié)因子[4-5]，其發(fā)揮作用的調節(jié)機制與許多癌癥有關，包括與HPV感染相關的癌癥。研究表明，HPV E6和E7癌基因表達參與調控并破壞細胞miRNA表達，許多細胞轉錄因子包括NF-κB、pRb和p53等已被確定可調節(jié)miRNA的轉錄[6]。miRNA(miR)-150位于染色體19q13，在大量癌癥，如白血病和結直腸癌中作為原發(fā)腫瘤miRNA發(fā)揮作用[7]，可通過促進腫瘤的發(fā)生和侵襲作為癌基因，或通過抑制腫瘤生長和轉移作為腫瘤抑制因子[8]。研究證明，miR-150異常表達和失調與各種類型的血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體瘤密切相關[9-10]。Abdelhalim等[9]通過對急性髓系白血病患者進行miR-150表達譜分析，表明miR-150在抑制細胞轉化中起到腫瘤抑制作用，并且減緩白血病病情發(fā)展。Tian等[11]證明p53上調凋亡調控因子(PUMA)可作為miR-150的潛在靶基因，表現(xiàn)為miR-150抑制PUMA從而誘導炎癥和β細胞凋亡，而NF-κB通過與miR-150啟動子結合激活miR-150表達，從而防止炎癥和β細胞凋亡。Fa等[12]通過對甲狀腺乳頭狀癌分析，證明黏蛋白4(MUC4)是miR-150的直接靶標，miRNA介導的MUC4下調與伴隨的人表皮生長因子受體2及其磷酸化形成的減少有關，從而抑制下游信號的激活。研究表明，miRNA可作為腫瘤抑制基因或致癌基因，并且相同的miRNA可在不同腫瘤類型中發(fā)揮相反的作用[13]。因此，miR-150表達譜及其在宮頸癌中的直接靶點仍難以捉摸。本研究旨在探討microRNA-150(miR-150)與宮頸癌細胞生物學功能的相關性。

1 材料與方法

1.1 資料來源 收集2017年1月至2018年12月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科收治的23例宮頸癌患者的癌組織及癌旁組織樣本?；颊逪PV16/HPV18陽性，平均年齡(52.00±11.91)歲，其中維吾爾族17例，漢族6例。收集正常宮頸上皮脫落細胞(cervical exfoliated cells，CEC)樣本10例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查和批準。宮頸癌細胞系SiHa(HPV16)及HeLa(HPV18)購自ATCC，并進行STR驗證。細胞培養(yǎng)使用10%胎牛血清、1%雙抗、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞轉染 miR-150 mimics(5'-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3')及miR mimics陰性對照(mimics-NC)(5'-CCGAAACCUCGGUUGAUUGCGG-3')購自上海生工。根據(jù)說明書，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)進行SiHa細胞及HeLa細胞轉染。置37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h用于進一步分析。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力 將SiHa及HeLa細胞按5×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24、48h和72h。每孔加10μL MTT(5mg/mL)，37℃孵育4h。取出棄上清，加二甲基亞砜(150μL/孔)，37℃下溶解甲臜晶體30min。使用Multiskan FC酶標儀(Thermo fisher,USA)于450nm波長處測量吸光度值。

1.2.3 細胞侵襲實驗 將SiHa及HeLa細胞按5×105細胞/mL接種至Transwell培養(yǎng)板上室，下室中加含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。孵育24h，用棉簽去除上室中未遷移細胞，濾膜下側的遷移細胞室溫下用100%甲醇固定15min，0.1%結晶紫染色。倒置顯微鏡下對遷移細胞進行計數(shù)。

1.2.4 RT-qPCR TRIzol試劑(ThermoFisher,Invitrogen,15596026)提取組織及細胞總RNA。按PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(Takara,RR037A)步驟，將提取的RNA樣品反轉錄合成cDNA。Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Takara,638315)試劑盒檢測miR-150表達，U6為內參基因。SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(Takara Biotechnology,Co.,Ltd.)檢測MUC4 mRNA表達，GAPDH(NM_001256799.3)為內參基因。qPCR引物購自上海生工(表1)。按95℃ 5min，1個循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 30s，40個循環(huán)設置熒光定量PCR儀(AGS，AFD4800)，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。進行3次實驗重復。

表1 引物信息

1.2.5 Western blot 用RIPA裂解緩沖液(Biosharp,BL504A)提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(biosharp,BL521A)定量總蛋白(40μg/泳道)，配制10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠，4%SDS-PAGE濃縮膠，上樣進行SDS-PAGE。將蛋白轉移到硝酸纖維素膜(PVDF)，置于5%BSA(biofroxx,4240GR025)室溫封閉2h，與一抗MUC4(1∶1000,ab60720,Abcam)、GAPDH(1∶1000.ab8245,Abcam)4℃孵育過夜。TBST洗滌膜3次，每次5min；將PVDF膜放入二抗稀釋液(1∶10,000,ab191866,ab218695,Abcam)，37℃水浴搖床避光孵育1h，TBST洗滌膜3次，每次5min。將ECL化學發(fā)光顯色試劑(Solarbio，PE0010)A液和B液1∶1混合均勻，均勻涂在目的條帶附近，在暗室中壓片曝光顯影。Image J軟件(V1.52s，Bharti Airtel Ltd)對膠片進行灰度掃描。

1.2.6 使用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染色的落射熒光顯微鏡檢測細胞自噬 miR-150 mimics轉染后48h收獲SiHa和HeLa細胞，并用5μg/mL AO及PI染料染色。使用ZISS ScopeA1熒光倒置顯微鏡在20×、40×物鏡下通過FITC/TRITC通道觀察并分析樣品。

1.2.7 生物信息學預測和雙熒光素酶報告基因檢測 使miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫Targetscan(www.targetscan.org/vert_71)和miRbase(https://www.mirbase.org/)預測miR-150的假定靶基因。為了研究miR-150對MUC4表達的直接影響，使用含MUC4 3'-UTR區(qū)域的pEZX-MT01靶標報告質粒(GeneCopoeia,Inc.,Rockville,MD,USA)。使用QuickchangeII定點突變試劑盒(200521,Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,USA)在野生型MUC4 3'-UTR (WT)中miR-150的預測靶位點進行定點誘變，生成MUC4 3'-UTR突變(MUT-MUC4 3' UTR)報告基因質粒。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)在96孔板中將報告基因質粒與miR-150 mimics或mimics-NC共轉染到細胞中。轉染后48h使用酶標儀檢測熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 宮頸癌中miR-150及MUC4表達 RT-qPCR檢測結果顯示，與匹配的癌旁組織相比，宮頸癌組織中miR-150相對表達量顯著降低、MUC4相對表達量顯著增高(P<0.01)(圖1A、B)；與正常宮頸上皮細胞系比較，SiHa、HeLa細胞中miR-150相對表達量顯著降低(P<0.01)，MUC4相對表達量顯著增高(P<0.01)(圖1C、D)。Western blot檢測結果顯示，宮頸癌組織中MUC4蛋白表達量顯著高于癌旁組織(P<0.01)(圖1E、F)。

2.2 miR-150 mimics轉染后抑制宮頸癌細胞的增殖及侵襲 miR-150 mimics轉染后，SiHa細胞及HeLa細胞中miR-150表達量均顯著高于mimics-NC組(P<0.05)；miR-150 mimics轉染后48、72h，SiHa、HeLa細胞增殖顯著抑制(P<0.05)，轉染后72h細胞侵襲顯著抑制(P<0.05),見圖2。

2.3 miR-150 mimics轉染后增加宮頸癌細胞的自噬 轉染后48h，收集宮頸癌細胞，AO及PI染色后熒光倒置顯微鏡觀察自噬情況并拍照。結果顯示，mimics-NC組細胞中主要為綠色熒光，細胞質和細胞核成分中的紅色熒光極少，提示基本上無自噬發(fā)生；miR-150 mimics組細胞顯示大量紅色熒光，表明形成了大量酸性自噬溶酶體液泡并誘導了早期細胞凋亡。同時，SiHa細胞及HeLa細胞呈現(xiàn)出典型的早期凋亡細胞形態(tài)，細胞核破碎，核膜受損。見圖3。

圖1 宮頸癌組織及細胞中miR-150及MUC4的表達

圖2 miR-150 mimics轉染后SiHa及HeLa細胞的增殖與侵襲

圖3 miR-150 mimics轉染后SiHa及HeLa細胞吖啶橙(AO)染色觀察細胞自噬

2.4 MUC4是miR-150的直接靶標 Targetscan和miRbase數(shù)據(jù)庫生物信息學分析預測結果示，MUC4為miR-150的潛在靶點，在MUC4 3'-UTR中鑒定了miR-150的假定結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測驗證miR-150是否介導MUC4表達。MUC4 mRNA的3'-UTR，包括推定的miR-150結合序列(WT 3'-UTR)或突變序列(MUT 3'-UTR)，被亞克隆到熒光素酶報告質粒中。與MUC4 WT共轉染的SiHa及HeLa細胞中，過表達miR-150導致熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而在與MUC4 MUT共轉染的SiHa及HeLa細胞中未降低。表明MUC4是miR-150的直接靶標。miR-150 mimics組SiHa及HeLa細胞中MUC4 mRNA和蛋白表達均顯著低于mimics-NC組(P<0.01)。見圖4。

圖4 雙熒光素酶報告基因檢測MUC4是miR-150的直接靶標

3 討 論

大量研究證明，miRNAs通過與靶mRNA的3'-UTR結合，在腫瘤發(fā)生和進展過程中作為基因表達的轉錄調節(jié)因子發(fā)揮著重要作用[14-16]。失調的miRNA參與調控腫瘤的多種生理過程，包括細胞增殖、藥物抗性、細胞凋亡、轉移和血管生成[17-18]。目前針對miRNAs的研究集中于癌癥特異性miRNA和相關靶基因，以期闡明癌癥發(fā)生的生物學機制[19-20]。miR-150是一種癌癥相關的miRNA，在各種癌癥中異常表達[21-22]。Zhang等[23]報道，miR-150在非小細胞肺癌(NSCLC)細胞中上調并且與存活顯著相關，并且miR-150表達增加促進了NSCLC細胞的增殖和遷移。Chen等[24]驗證了過表達miR-150-5p在體外/體內均抑制了結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和血管生成，而下調miR-150-5p在體外促進了結直腸癌的進展。本研究證實，與正常組織相比，宮頸癌組織中miR-150表達顯著下調，轉染miR-150類似物至宮頸癌細胞(SiHa/HeLa)后，宮頸癌細胞的增殖速度顯著降低，宮頸癌細胞形成了大量酸性自噬溶酶體液泡并出現(xiàn)了早期細胞凋亡現(xiàn)象，即細胞核破碎，核膜受損，這提示miR-150可抑制細胞增殖并增加宮頸癌細胞的自噬及凋亡。這些結果表明，miR-150可能在宮頸癌中發(fā)揮著腫瘤抑制的作用，進一步分析miR-150的靶位點以確定miR-150在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中潛在的分子機制。

生物信息學分析預測MUC4為miR-150的潛在靶標。MUC4是一種高分子量的I型跨膜蛋白，在多種癌癥中異常表達，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和膀胱癌，并且在功能上與腫瘤的發(fā)生、轉移和腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互作用有關[25]。MUC4在胰腺癌中過度表達，并有助于胰腺癌的侵襲性和轉移[26-27]。MUC4還在卵巢癌中過度表達并促進卵巢癌細胞的病理生物學和侵襲性[28]。MUC4在腫瘤發(fā)生過程中的腸細胞增殖中也起著關鍵作用[29]。Rowson-Hodel等[30]研究表明，異常表達的MUC4可導致增加乳腺癌的轉移效率。這些結果表明，根據(jù)特定的癌癥和細胞環(huán)境，MUC4的作用似乎很復雜。因此，MUC4在人類腫瘤中的表達和功能尚不清楚。研究表明，miRNA長度約為20nt，在發(fā)揮功能前會誘導形成沉默復合物(miRISC)，該復合物通過堿基互補的方式與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)結合，導致它們的翻譯抑制、去腺苷酸化和衰變，從而調控靶基因的表達[31-32]。本研究通過雙熒光素酶報告基因檢測并通過人工合成miR-150類似物轉染人類宮頸癌細胞，證明miR-150可能通過靶向結合MUC4基因的3'-UTR區(qū)域，抑制其基因表達。由于miR-150的靶基因眾多，需進一步研究miR-150通過宮頸癌中的MUC4作為腫瘤抑制因子的功能。

綜上所述，miR-150具有抗腫瘤特性并抑制宮頸癌細胞的生長與侵襲，增加宮頸癌細胞的自噬。miR-150可直接靶向MUC4，其可能是通過下調MUC4進而調控宮頸癌細胞的生物學行為。本研究可為宮頸癌的診斷和治療策略提供新的見解。