日本落葉松內(nèi)源GUS基因鑒定及其酶活性分析

摘要：[目的]研究日本落葉松內(nèi)源口_葡糖苷酸酶（ GUS）基因及其酶活性，分析GUS作為報告基因的可靠性。[方法]利用pCAMBIA1301載體上的GUS基因序列在日本落葉松參考基因組中進行比對，鑒定并克隆出日本落葉松GUS（LaGUS）基因。在NCBI利用blastp查找其他物種中La GUS的同源序列并構(gòu)建進化樹。利用已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實時熒光定量PCR分析La GUS基因在日本落葉松中的襲這模式。利用組織化學(xué)的方法，以X-gluc作為GUS酶反應(yīng)底物，檢測日本落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中內(nèi)源GUS的酶活性。[結(jié)果]在日本落葉松中鑒定到一個LaGUS基因，CDS長3 435 bp，編碼1144個氨基酸。25種植物中具有與LaGUS基因相似的序列。LaGUS基因的表達量在活動期高于休眠期，在體胚苗中高于在胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚胎中。組織化學(xué)染色表明，日本落葉松胚性愈傷組織、體細(xì)胞胚胎和體胚苗在室溫下染色6d對均觀察到藍色，但體胚苗的染色程度高于胚性愈傷維織和體細(xì)胞胚胎。[結(jié)論]日本落葉松具有內(nèi)源GUS括性，在基因工程中利用GUS作為報告基因可能存在一定干擾。

關(guān)鍵詞：日本落葉松；內(nèi)源GUS；體細(xì)胞胚胎發(fā)生；報告基因

中圖分類號：S722.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）06-0086-07

B-葡糖苷酸酶（p-glucuronidase，GUS）是一種水解酶，可將5-溴-4-氯-3-吲哚-B-葡萄糖苷酸（X-Gluc）分解，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，因而被作為報告基因廣泛使用。自1987年GUS基因被克隆后，就被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究中。將目的基因或其啟動子與GUS融合后，可以借助組織化學(xué)染色法對目的基因的表達進行定位和定量分析。比如，可以通過對整株植物進行染色，了解目的基因在不同器官中的表達式樣，也可以在染色后進行切片，在組織水平上分析目的基因的表達特點。

然而，越來越多的研究者在進行GUS活性檢測時，發(fā)現(xiàn)了假陽性或者檢測出內(nèi)源GUS活性的情況。1986年，Schulz等在黑麥（Secale cereale L.）葉片發(fā)育初期檢測到很強的GUS活性。Wozniak等發(fā)現(xiàn)甜菜（Beta vulgariL）中具有內(nèi)源GUS活性。Hu等使用多種方法檢測了52種植物中的內(nèi)源GUS活性，發(fā)現(xiàn)有些植物的種皮、胚乳，特別是成熟胚中存在GUS活性，這些植物不僅有被子植物，還有裸子植物。Muhitch等發(fā)現(xiàn)在排除了共生細(xì)菌的干擾后，在玉米（Zeamays L.）花梗中仍然能夠檢測到GUS活性。此后，施華中等也報道了煙草（Nicotiana tabacum L.）花粉及其他組織中內(nèi)源GUS活性的存在。上述研究表明，當(dāng)植物本身具有內(nèi)源GUS活性，GUS作為報告基因會影響轉(zhuǎn)基因植物的陽性檢測、瞬時表達效率分析和基因表達模式分析。

基于體細(xì)胞胚胎發(fā)生的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系是針葉樹中相對成熟的實驗系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)不僅可開展落葉松（Larix）基因的表達調(diào)控和功能驗證等研究，還可以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因落葉松新種質(zhì)。目前，作為報告基因，GUS在落葉松遺傳轉(zhuǎn)化時也經(jīng)常被使用。為了準(zhǔn)確、高效地篩選轉(zhuǎn)基因材料、分析落葉松基因功能和啟動子活性，本研究從日本落葉松（Larix kaempferi（Lamb.）Carr.）基因組中鑒定GUS基因，并分析日本落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的內(nèi)源GUS活性，以此為依據(jù)判斷外源GUS在日本落葉松遺傳轉(zhuǎn)化中作為報告基因的可靠性，為日本落葉松遺傳轉(zhuǎn)化研究中報告基因的選擇和利用提供理論依據(jù)。

1研究材料與方法

1.1研究材料

實時熒光定量PCR和組織化學(xué)染色實驗中所用的材料來自日本落葉松未成熟種子誘導(dǎo)獲得的胚性愈傷組織C6。未成熟種子于6月中下旬采自遼寧省國有清原滿族自治縣大孤家林場1.5代園。胚性愈傷組織經(jīng)成熟培養(yǎng)獲得體細(xì)胞胚胎，體細(xì)胞胚胎經(jīng)萌發(fā)培養(yǎng)獲得體胚苗。這些材料均為本實驗室日常培養(yǎng)獲得，培養(yǎng)方法參考已發(fā)表文獻。

1.2研究方法

1.2.1日本落葉松內(nèi)源GUS基因鑒定與克隆 以pCAMBIA1301載體中GUS基因的蛋白序列為參照，利用blastp在日本落葉松基因組數(shù)據(jù)庫中查找日本落葉松內(nèi)源GUS序列，E值lt;10-5。將比對獲得的相似度最高的基因視為日本落葉松內(nèi)源GUS基因，命名為LaGUS。

根據(jù)LaGUS的核酸序列，設(shè)計引物（表1），以日本落葉松cDNA為模板擴增其編碼區(qū)（Coding Sequence，CDS）序列。PCR反應(yīng)體系（50 uL）：25 uL KOD Mix，1.5 uL F引物（10 umol·L-1），1.5 uL R引物（10 umol·L-1），1.0 uL cDNA（200 ng·mL-1）， 21 UL ddH2O。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；按下列循環(huán)參數(shù)進行擴增反應(yīng)：95℃，5s；60℃，5s；68℃，30 s 30個循環(huán)；68℃，5min；產(chǎn)物于4℃保存。對擴增獲得的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，確認(rèn)條帶大小一致后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TianGen，中國）進行純化回收。將回收后的PCR產(chǎn)物進行TA克隆，轉(zhuǎn)化至TransT1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（TianGen，中國），挑取陽性克隆送公司測序。

1.2.2日本落葉松內(nèi)源GUS基因的序列分析 利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)站預(yù)測LaGUS蛋白的分子量和等電點。利用Euk-mPLoc 2.0在線工具（http：//www.csbio.sjtu，edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）預(yù)測LaGLIS蛋白的亞細(xì)胞定位。

利用NCBI中的blastp功能（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索Laeus基因的同源序列。利用ClustaIX軟件進行序列比對，隨后使用MEGA6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)置為1 000，其他參數(shù)按照系統(tǒng)默認(rèn)設(shè)置。

1.2.3LaGUS基因的表達分析 利用本實驗室已發(fā)表的日本落葉松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對Laeus基因的表達模式進行分析，這些轉(zhuǎn)錄組來自1～50年生處于活動期或休眠期的日本落葉松的莖。將測序獲得的序列比對到落葉松基因組，重新計算基因的表達量。

使用日本落葉松的胚性愈傷組織、體細(xì)胞胚胎和體胚苗進行qRT-PCR分析。足量材料混合后提取RNA，提取步驟按照說明書進行（ER101，北京全式金生物技術(shù)）。使用超微量分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度及純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（P10720，北京全式金生物技術(shù)）將1 ug檢測合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA稀釋10倍后作為模板，以LaEF7A1和LaUBC為內(nèi)參基因進行qRT-PCR檢測，引物序列見表1。qRT-PCR的反應(yīng)體系為：12.5 uLTB Green Premix Ex TaqTM，2 uL cDNA，F(xiàn)、R引物各0.5 uL，9.5 uL RNase-free水。反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃，5 s，60℃，30 s，45個循環(huán)；95℃，10 s；65℃，5s；95℃，5s。每個反應(yīng)3個技術(shù)重復(fù)。基因的相對表達量用2-△△C法計算，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）。采用SPSS 22.0進行LSD多重比較法。

1.2.4日本落葉松內(nèi)源GUS活性檢測 挑取適量胚性愈傷組織、體細(xì)胞胚胎和體胚苗于1.5 mL離心管內(nèi)，使用北京華越洋GUS染色試劑盒（Cat：GT0391）進行染色，按照試劑盒說明書，GUS染色濃縮液使用前用GUS染色緩沖液稀釋50倍后配成GUS染色液后，在室溫下進行染色。觀察到藍色時表明該材料具有GUS酶活性并拍照記錄。每個反應(yīng)3個技術(shù)重復(fù)，每個獨立實驗至少有4個生物學(xué)重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1日本落葉松GUS基因的鑒定、克隆與分析

利用pCAMBIA1301載體中GUS基因的蛋白序列在日本落葉松基因組中進行搜索，序列相似度最高的基因被視為日本落葉松GUS基因，將其命名為LaGUS。根據(jù)該基因的序列，設(shè)計特異性引物，以日本落葉松胚性愈傷組織、體細(xì)胞胚胎和體胚苗中提取的cDNA為模板進行PCR擴增，在2 000～4 000 bp區(qū)間獲得了單一條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。測序結(jié)果表明，LaGUS基因的CDS序列長3 435 bp，與參考基因組序列相比，在第2 247個堿基處具有一個G-A同義突變；該序列已上傳至NCBI，登錄號為PP129346.1。該基因編碼1 144個氨基酸的蛋白，其分子量為130.06 kD，理論等電點為5.59，亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示其定位在溶酶體。

利用LaGUS基因的蛋白序列在NCBI中進行搜索，發(fā)現(xiàn)超過60個物種中存在LaGUS基因的同源序列，并且蛋白序列的相似度超過50％，其中很多序列被注釋為B-葡糖苷酸酶。根據(jù)相似度，選擇前25個物種的序列，構(gòu)建LaGUS同源基因蛋白序列的進化樹。結(jié)果表明，日本落葉松與日本柳杉（Cryptomeria japonica（Linn.f.）DDon）和無油樟（Amborella trichopoda Baill.）聚類到一個大的分支，其中，日本落葉松與日本柳杉較近；間型紫萍（Spirodela intermedia（ L.）Schleid.），風(fēng)梨（Ananas comosus（L.）Merr.）和海棗（phoenix dactylifera L.）聚類到另一分支，這一支與日本落葉松較遠(yuǎn)（圖2）。

2.2LaGLIS基因的表達分析

利用前期獲得的日本落葉松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對LaGUS基因的表達模式進行了分析。在1～50年生日本落葉松的莖中，LaGUS基因在活動期的表達水平顯著高于體眠期（圖3A）。在日本落葉松愈傷組織、體細(xì)胞胚胎和體胚苗中均檢測到LaGUS基因的表達，但體胚苗中表達水平最高（圖3B）。

2.3日本落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的內(nèi)源GUS活性

胚性愈傷組織、體細(xì)胞胚胎和體胚苗常用于篩選轉(zhuǎn)基因材料、分析基因功能和啟動子活性。本研究檢測了日本落葉松上述材料中的內(nèi)源GUS活性；結(jié)果表明，未染色時，胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚胎分別為白色和黃色，而在染色6d的時侯，這些材料中觀察到了藍色（圖4）；未染色時，體胚苗的子葉和胚軸為綠色，胚根為褐色，而在染色6d、乙醇脫色后，整個體胚苗中都觀察到了藍色，且子葉和胚軸中藍色更深（圖3）。

3討論

隨著測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，大量植物基因被挖掘出來，功能基因的篩選、驗證與應(yīng)用將是未來的研究重點。體細(xì)胞胚胎發(fā)生與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是針葉樹新種質(zhì)創(chuàng)制的重要途徑，具有不可替代的地位。因此，轉(zhuǎn)基因材料的快速檢測可以提高新種質(zhì)創(chuàng)制的效率。GUS作為報告基因已被廣泛應(yīng)用到植物轉(zhuǎn)基因研究中，然而，由于存在內(nèi)源GUS活性，使得轉(zhuǎn)基因材料的檢測結(jié)果受到了影響，進而降低了轉(zhuǎn)基因研究的效率。研究植物內(nèi)源GUS基因及其活性將有助于增強轉(zhuǎn)基因材料檢測的可靠性和準(zhǔn)確性，進而提高轉(zhuǎn)基因研究的效率。

本研究克隆了日本落葉松的一個內(nèi)源GUS基因，比對與進化分析結(jié)果表明，其他植物中也存在與LaGUS基因序列相似度較高的序列，在設(shè)計引物、進行外源GUS基因表達檢測時，這些序列可以用來作為參考，避免非特異性擴增帶來的干擾。值得注意的是，在這25種植物中，蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）和牛油果（Persea americana Mill.）中也檢測到了內(nèi)源GUS活性，暗示在其他具有LaGUS同源序列的植物中也可能存在內(nèi)源GUS活性。LaGUS的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示其定位在溶酶體，進一步表明其可能具有水解酶的功能。表達分析結(jié)果表明，LaGUS基因的表達水平在休眠期低、活動期高（圖3），表明LaGUS基因的表達具有季節(jié)性，環(huán)境信號可能調(diào)控其表達。

在日本落葉松胚性愈傷組織、體細(xì)胞胚胎和體胚螢中均檢測到LaGUS基因的表達和酶活性，且體胚苗中的表達水平和染色程度均高于愈傷組織和體細(xì)胞胚胎，表明日本落葉松體胚苗中具有更高的內(nèi)源GUS活性（圖3、4）。在落葉松遺傳轉(zhuǎn)化過程中愈傷組織常用來進行陽性檢測。在研究日本落葉松La TCTP啟動子活性的過程中，外源GUS基因表達水平高的愈傷組織被染為藍色，而表達水平低的愈傷組織未被染為藍色；這些結(jié)果表明，即使是轉(zhuǎn)基因陽性材料，其在一定條件下也不能染出藍色。在本研究中，未轉(zhuǎn)基因的愈傷組織及其進一步培養(yǎng)而產(chǎn)生的體細(xì)胞胚胎和體胚苗在染色6d后也能顯現(xiàn)藍色，進一步說明僅根據(jù)GUS染色結(jié)果去鑒定轉(zhuǎn)基因材料是不可靠的。因此，在利用GUS作為報告基因和檢測目標(biāo)的時候，應(yīng)考慮植物內(nèi)源GUS基因及其酶活的影響，盡量避免假陽性或假陰性的干擾。

越來越多報告基因的出現(xiàn)為植物轉(zhuǎn)基因研究提供了更多選擇。比如最近報道的RUBY，該系統(tǒng)已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）、水稻（Oryza sativaL）、玉米、番茄（Solanum/ycopers/con L.）和毛竹（Phyllostachys edulis（Carriare）J.Houz.）等單子葉或多子葉的被子植物轉(zhuǎn)基因研究中得到了應(yīng)用，是否可以在多子葉裸子植物的轉(zhuǎn)基因研究中進行應(yīng)用仍需要進一步研究。

4結(jié)論

本研究分析了日本落葉松的一個內(nèi)源GUS基因LaGUS，并在日本落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中檢測到了它的表達和內(nèi)源GUS酶活性，發(fā)現(xiàn)體胚苗中LaGUS的表達水平和內(nèi)源GUS酶活性均高于胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚胎。內(nèi)源GUS酶活性的存在會干擾轉(zhuǎn)基因材料的檢測，尤其在利用具有內(nèi)源GUS酶活性的植物開展轉(zhuǎn)基因研究時，報告基因GUS的利用要特別小心，盡量排除內(nèi)源GUS基因及其酶活性的干擾，以提高轉(zhuǎn)基因材料檢測的可靠性和準(zhǔn)確性。