啟動(dòng)子陷阱技術(shù)在植物啟動(dòng)子克隆研究中的應(yīng)用

李季++黃天帶++華玉偉++黃華孫

摘 要 啟動(dòng)子陷阱技術(shù)是一種報(bào)告基因的隨機(jī)整合技術(shù)，現(xiàn)已成為基因功能研究中的重要手段。從啟動(dòng)子陷阱技術(shù)的原理、啟動(dòng)子陷阱報(bào)告基因的種類(lèi)、啟動(dòng)子陷阱在植物中的應(yīng)用及在應(yīng)用過(guò)程中存在的問(wèn)題等方面進(jìn)行綜述，并針對(duì)有關(guān)問(wèn)題進(jìn)行討論和展望。

關(guān)鍵詞 啟動(dòng)子陷阱 ；T-DNA ；報(bào)告基因 ；功能研究

分類(lèi)號(hào) Q75

Application of Promoter-trap in Promoter Cloning Research of Plants

LI Ji HUANG Tiandai HUA Yuwei HUANG Huasun

（Rubber Research Institute， CATAS /

Key Laboratory of Rubber Biology， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract Promoter-trap is a random integration of a reporter gene constructs， which provides extremely powerful tools for gene functional research. In this review， the cloning method of promoter， the principle of promoter trap， the choice of reporter gene， and the applications and the questions of promoter-trap were described in detail， In the end， the related problems with prospect were discussed.

Keywords promoter-trap ； T-DNA ； reporter gene ； functional research

啟動(dòng)子是RNA聚合酶能夠識(shí)別并與之結(jié)合，從起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因的上游。目前常用的啟動(dòng)子克隆方法有利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子[1]、PCR法克隆啟動(dòng)子[2-3]及啟動(dòng)子陷阱技術(shù)[4-6]等。雖然啟動(dòng)子探針?lè)ú恍柚谰唧w的基因序列，并且能獲得大量的啟動(dòng)子片段，但整個(gè)過(guò)程工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。PCR法克隆啟動(dòng)子操作簡(jiǎn)單、便捷，但必須以已知的基因序列或基因片段為前提。啟動(dòng)子陷阱方法依賴(lài)于報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)鑒定基因及其啟動(dòng)子，因此不需要已知突變表型和基因序列，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、動(dòng)物和植物中[7-10]。通過(guò)建立高效穩(wěn)定的啟動(dòng)子捕獲系統(tǒng)，構(gòu)建包含報(bào)告基因隨機(jī)插入整個(gè)基因組的個(gè)體突變體庫(kù)，已成為當(dāng)前未知序列基因啟動(dòng)子克隆的常用方法之一。

1 啟動(dòng)子陷阱技術(shù)的原理

啟動(dòng)子陷阱（Promoter-trap）是將一個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)告基因隨機(jī)插入到基因組DNA的外顯子上，一旦發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞基因組中的基因被共同轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則表明該報(bào)告基因附近有啟動(dòng)子，從而起到以之為誘餌、發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子的目的。報(bào)告基因與被插入的基因及其調(diào)控序列緊密連鎖，這樣通過(guò)載體上的序列就很容易分離相應(yīng)的啟動(dòng)子，而報(bào)告基因的表達(dá)模式也就反映出被插入基因所具有調(diào)控序列的特性[11]，該技術(shù)的利用依賴(lài)于報(bào)告基因的高頻率、多模式表達(dá)，為在限制細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)的基因或在發(fā)育過(guò)程中短暫時(shí)間表達(dá)的基因鑒定和克隆提供了強(qiáng)有力的工具[9，12]。啟動(dòng)子陷阱的構(gòu)建需要建立報(bào)告基因插入基因組的個(gè)體突變庫(kù)，主要采取T-DNA和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)2種方式[13-14]，而T-DNA介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是主要方法。構(gòu)建啟動(dòng)子陷阱載體時(shí)，一般優(yōu)先將無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)告基因與T-DNA的右邊界相鄰，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有功能的轉(zhuǎn)錄基因融合頻率為54%，而翻譯融合頻率為1.6%[15]，左邊界的無(wú)啟動(dòng)子gusA基因在不同植物中的表達(dá)頻率不同[4]。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)中目前只有Ac/Ds可用于基因陷阱的構(gòu)建，該系統(tǒng)同樣利用T-DNA介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將Ac（活化因子）插入到植物基因組中，Ac/Ds轉(zhuǎn)座子具有偏好向鄰近連鎖位置進(jìn)行轉(zhuǎn)座的特性[16]，因此，不僅增加了構(gòu)建突變庫(kù)的工作量，而且不適合雜交困難的植物。

2 啟動(dòng)子陷阱的報(bào)告基因

啟動(dòng)子陷阱中常用的報(bào)告基因有GUS（β-葡萄糖醛酸酶）、luc（熒光素酶）、GFP（綠色熒光蛋白）和Lc（花青素調(diào)節(jié)基因）等。目前，GUS基因是最常用的報(bào)告基因，GUS蛋白相當(dāng)穩(wěn)定且靈敏，但底物價(jià)格較貴，且其在染色和脫色的過(guò)程中會(huì)破壞組織，不能在活體組織中進(jìn)行分析[17]，這就限制了其在多種植物大規(guī)模篩選中的應(yīng)用。luc或GFP作為一種非破壞性的報(bào)告基因已成為基因捕獲系統(tǒng)中常見(jiàn)的報(bào)告基因[18-19]，其無(wú)需反應(yīng)底物和輔助因子，直接通過(guò)適當(dāng)?shù)墓庠催M(jìn)行熒光檢測(cè)，可在活細(xì)胞中進(jìn)行多次非破壞性的檢測(cè)，對(duì)植物本身無(wú)傷害，但某些植物體內(nèi)具有高水平的自發(fā)熒光[20]，且當(dāng)GFP蛋白含量較高時(shí)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生能力下降，使GFP基因在用于篩選轉(zhuǎn)基因植物時(shí)受到局限[21]，同時(shí)需借助熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡等比較昂貴的大型設(shè)備才能準(zhǔn)確的檢測(cè)。Lc作為玉米Myc-like轉(zhuǎn)錄因子的R基因家族成員之一，調(diào)控花青素的生物合成，該報(bào)告基因不需要昂貴的底物，并且不具有破壞性，在大規(guī)模、田間栽培植物中更加具有應(yīng)用前景，但高表達(dá)Lc編碼的轉(zhuǎn)錄因子會(huì)造成表型的影響[22]。

3 啟動(dòng)子陷阱技術(shù)的應(yīng)用

起初啟動(dòng)子陷阱技術(shù)主要應(yīng)用于動(dòng)物與微生物的基因或啟動(dòng)子克隆方面[23-24]，也取得了較大進(jìn)展[25]。而在植物中起步相對(duì)較晚，早期主要是以克隆新的基因?yàn)橹鳌opping等[26]利用啟動(dòng)子陷阱載體研究早代胚胎發(fā)生的基因，其中鑒定了一個(gè)株系對(duì)應(yīng)的cDNA，表明這個(gè)標(biāo)簽序列被轉(zhuǎn)錄。隨后，Topping等[27]為研究擬南芥胚和籽苗中建立的極性構(gòu)成機(jī)制，利用啟動(dòng)子陷阱鑒定了在根尖頂端至基部表達(dá)的3個(gè)分子標(biāo)記。Eastmond等[28]通過(guò)啟動(dòng)子陷阱成功的分離了一個(gè)新的擬南芥酰基輔酶A氧化酶基因AtACX3，在acx3突變體籽苗中，中鏈的?；o酶A氧化酶活性降低了95%，長(zhǎng)鏈及短鏈的活性未改變。Meissner等[29]利用玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)獲得了番茄的Ds因子轉(zhuǎn)座并穩(wěn)定的家系，為高通量分析番茄中的功能基因和啟動(dòng)子的分離鑒定奠定基礎(chǔ)，與此同時(shí)，利用熒光素酶基因作為報(bào)告基因優(yōu)化了啟動(dòng)子陷阱載體。Tanaka等[30]從NASC提供的啟動(dòng)子陷阱系中重新分離了一個(gè)N35株系，其GUS報(bào)告基因在下胚軸表達(dá)，并且表現(xiàn)為依賴(lài)于遠(yuǎn)紅外光處理。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，報(bào)告基因插入到擬南芥同源的大豆GH3基因，RNA blot分析進(jìn)一步證實(shí)，該基因確實(shí)對(duì)光照存在反應(yīng)。

與此同時(shí)，利用啟動(dòng)子陷阱技術(shù)克隆有功能的植物自身啟動(dòng)子的策略是可行的[31]。Jeon等[32]嘗試用無(wú)啟動(dòng)子的GUS基因構(gòu)建在T-DNA上，通過(guò)T-DNA的隨機(jī)插入，來(lái)分離水稻中的啟動(dòng)子。Bade等[33]將一個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的gus：：nptII陷阱載體轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，選擇3個(gè)T-DNA插入單拷貝的株系進(jìn)行了啟動(dòng)子的分離，通過(guò)瞬時(shí)和穩(wěn)定的GUS活性檢測(cè)證明這些新的序列具有啟動(dòng)子活性。Alvarado等[18]利用攜帶有無(wú)啟動(dòng)子的luc報(bào)告基因的啟動(dòng)子陷阱載體pTluc轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得具有組成型、組織特異型和脅迫誘導(dǎo)型的熒光素酶表達(dá)模式的轉(zhuǎn)基因株系。Jin等[5]研究結(jié)果初步證明啟動(dòng)子陷阱技術(shù)在棉花功能基因組學(xué)研究中的可行性，并提出建立的啟動(dòng)子陷阱系統(tǒng)中GUS基因高頻率、多模式和時(shí)空特異性表達(dá)，這為分離基因及其調(diào)控序列，開(kāi)展棉花功能基因組學(xué)奠定研究基礎(chǔ)。Santos等[19]設(shè)計(jì)并應(yīng)用一種高通量的real-time結(jié)合熒光素酶依賴(lài)的啟動(dòng)子陷阱載體的體外篩選平臺(tái)，鑒定和分離香蕉低溫誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子，該系統(tǒng)或類(lèi)似的系統(tǒng)可成功的應(yīng)用于具有較好體外再生體系的物種。魏小慧等[34]利用啟動(dòng)子捕獲技術(shù)建立了橡膠樹(shù)炭疽病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，提出啟動(dòng)子捕獲技術(shù)更適合開(kāi)展植物病原菌致病分子生物學(xué)的研究。同時(shí)抗性宿主基因型中類(lèi)似轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子識(shí)別位點(diǎn)最常用策略為利用啟動(dòng)子陷阱調(diào)取與執(zhí)行類(lèi)型抗性基因（E基因）相結(jié)合的啟動(dòng)子，如水稻的Xa27基因和胡椒的Bs3基因[6]。在木本植物橡膠樹(shù)中，也首次通過(guò)啟動(dòng)子陷阱技術(shù)初步獲得了1個(gè)組成型表達(dá)啟動(dòng)子和1個(gè)根特異性表達(dá)啟動(dòng)子[35]。

4 啟動(dòng)子陷阱在基因組學(xué)研究中的問(wèn)題及展望

4.1 問(wèn)題

4.1.1 啟動(dòng)子或基因的確定較困難且耗時(shí)較長(zhǎng)

通過(guò)啟動(dòng)子陷阱載體可挖掘相應(yīng)的啟動(dòng)子或基因，但通過(guò)克隆和篩選融合轉(zhuǎn)錄物獲融合蛋白費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前較為常見(jiàn)的是通過(guò)Tail-PCR方法來(lái)獲得其插入的側(cè)翼序列，然后通過(guò)生物信息學(xué)分析獲得啟動(dòng)子或基因，但Tail-PCR方法在反應(yīng)過(guò)程中需要較多的引物組合。由于AD（Arbitrary degenerate，隨機(jī)簡(jiǎn)并）引物存在有限的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)個(gè)別的側(cè)翼序列，即便用不同的簡(jiǎn)并引物也難以擴(kuò)增到陽(yáng)性結(jié)果。目前提出用RAPD引物替代AD引物的觀點(diǎn)，由于RAPD引物數(shù)量很多，所以可解決AD引物存在有限的結(jié)合位點(diǎn)的不足問(wèn)題，此外，Tail-PCR法對(duì)引物和模板純度的要求較高且擴(kuò)增的片段為高度重復(fù)序列時(shí)，該方法無(wú)法步移。

4.1.2 可導(dǎo)致基因的失活或報(bào)告基因表型喪失

啟動(dòng)子陷阱載體要求插入在一個(gè)基因的外顯子上，可能會(huì)導(dǎo)致基因失活。啟動(dòng)子捕獲載體具有DNA插入的偏向性，且只能捕獲有轉(zhuǎn)錄活性的基因[36]。其需要插入的方向正確，而在T-DNA的左右兩側(cè)分別插入1個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)告基因，是否可能會(huì)避免由于T-DNA插入方向的不正確造成報(bào)告基因無(wú)法表達(dá)的問(wèn)題還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證[35]。若報(bào)告基因未按預(yù)期加以整合，或者報(bào)告基因被剪接時(shí)整個(gè)被切除，都有可能使報(bào)告基因的表型喪失[37]。

4.1.3 依賴(lài)于轉(zhuǎn)基因體系的建立

啟動(dòng)子陷阱技術(shù)成功應(yīng)用的先決條件是具備有效的植物轉(zhuǎn)化機(jī)制。目前T-DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化仍是常用方法，模式植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系比較成熟，但木本植物的轉(zhuǎn)化起步較晚，其遺傳轉(zhuǎn)化體系還不夠完善，轉(zhuǎn)化效率較低，這對(duì)于由啟動(dòng)子陷阱的遺傳轉(zhuǎn)化獲得陽(yáng)性植株帶來(lái)一定的困難。

4.1.4 多拷貝植株分析的復(fù)雜性

利用T-DNA介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化啟動(dòng)子陷阱載體，在獲得的轉(zhuǎn)化植株中，通常可檢測(cè)到一個(gè)位點(diǎn)包含多個(gè)T-DNA插入或者多個(gè)位點(diǎn)包含有多個(gè)插入，甚至發(fā)生T-DNA的正向或反向重復(fù)，以及與比鄰的染色體發(fā)生重排等，這些都給后期的分子分析帶來(lái)較大的復(fù)雜性，增加了啟動(dòng)子的分離難度[9，38]。

4.2 展望

自啟動(dòng)子陷阱技術(shù)出現(xiàn)后，用其進(jìn)行啟動(dòng)子及基因的克隆一直受到研究者的青睞。傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法并不是對(duì)所有的重要功能基因都能進(jìn)行研究，其中包括低水平表達(dá)的、在發(fā)育各個(gè)階段均發(fā)揮重要作用的重要基因，突變后可能會(huì)導(dǎo)致在早期致死或高度多效性及在實(shí)驗(yàn)室條件下功能上融合表達(dá)，基因缺失后，成為表型變化不明顯的功能冗余基因。而啟動(dòng)子陷阱技術(shù)可很好的解決上述基因的研究，提高標(biāo)記基因插入基因組的機(jī)率，并不需要產(chǎn)生可見(jiàn)的功能缺失突變體，可很好的分離特異性表達(dá)的基因，具有更為廣泛的應(yīng)用前景。其次，利用啟動(dòng)子陷阱技術(shù)構(gòu)建的突變體庫(kù)也將為利用反向遺傳學(xué)研究基因功能奠定基礎(chǔ)，獲得的突變體將為分子生物學(xué)研究提供良好材料。近期的研究結(jié)果表明，內(nèi)源啟動(dòng)子與受體系統(tǒng)兼容性較好，在目的基因高效、穩(wěn)定及持久表達(dá)等方面較外源啟動(dòng)子更具優(yōu)勢(shì)[39]。而啟動(dòng)子陷阱技術(shù)是挖掘內(nèi)源啟動(dòng)子強(qiáng)有力的工具，將會(huì)對(duì)內(nèi)源組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的挖掘等方面研究發(fā)揮更大的作用。

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