全外顯子測序檢測6個囊性腎病胎兒及其核心家系的致病突變*

周 靜，馬定遠(yuǎn)，吳 云，楊 玲，朱愛紅，李 璃，羅春玉，張菁菁，胡 平，許爭峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，南京 210004)

囊性腎病是一種較常見的胎兒發(fā)育異常，主要由于腎臟誘導(dǎo)和分化的缺陷，囊性組織代替了腎臟實(shí)質(zhì)。囊性腎病的臨床特征為超聲可見的胎兒單側(cè)或雙側(cè)出現(xiàn)一個或多個囊性病變，可同時伴隨羊水過少或無羊水，以及其他腎外表現(xiàn)。導(dǎo)致囊性的原因很多，遺傳因素是重要的一部分。鑒于胎兒囊性腎病突出的遺傳異質(zhì)性和不同基因序列結(jié)構(gòu)的差異較大，突變基因的檢測和致病性的確立較為復(fù)雜和具有技術(shù)挑戰(zhàn)性。本研究運(yùn)用家系全外顯子檢測結(jié)合Sanger測序技術(shù)，對CMA結(jié)果陰性、排除了綜合征性囊性腎病的6個胎兒及其核心家系進(jìn)行檢測，尋找基因水平可能的致病性變異。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2015年1月1日至2020年12月就診于南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，6個因胎兒囊性腎病(圖1)要求基因診斷的家系，因孕期(妊娠16+5～35+5周)超聲提示胎兒為囊性腎病終止妊娠(1例為晚期妊娠因雙腎多囊樣發(fā)育不良經(jīng)多學(xué)科會診同意終止妊娠)，經(jīng)知情同意，采集胎兒皮膚標(biāo)本和父母外周血標(biāo)本。本研究經(jīng)南京市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)。

圖1 囊性腎病胎兒腎臟超聲圖A:病例1;B:病例2;C:病例3；D:病例4;E:病例5;F:病例6

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 經(jīng)知情同意采集胎兒皮膚標(biāo)本2cm×2cm×2cm和父母外周血5mL，分別使用愷碩組織樣品和血液基因組DNA提取試劑盒，按操作流程提取DNA，NanoDrop2000分光光度儀測定DNA濃度，所有DNA濃度>100ng/μL，吸光度A260nm/A280nm為1.8～2.0。

1.2.2 構(gòu)建文庫和家系外顯子測序 Covaris超聲波DNA破碎儀將提取的胎兒組織和雙親外周血基因組DNA片段化為150～200bp大小，末端修復(fù)，加腺苷尾，連接接頭，PCR擴(kuò)增得到基因組DNA文庫。使用安捷倫SureSelectXT目標(biāo)富集系統(tǒng)雜交、外顯子捕獲、PCR擴(kuò)增后，在Illumina Hiseq2500測序平臺進(jìn)行高通量測序。實(shí)驗(yàn)流程中的質(zhì)控均符合要求，最終文庫質(zhì)量符合要求。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 測序所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)去接頭、去重復(fù)和過濾，有效數(shù)據(jù)經(jīng)國際和國內(nèi)有共識的公共數(shù)據(jù)庫比對，按遺傳模式、發(fā)病時間、突變的人群頻率、危害性預(yù)測分析等，再將基因功能通過OMIM、HGMD、NCBI等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，根據(jù)ACMG(2015)及補(bǔ)充要求、ClinGen序列變異解釋專家組對指南標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用建議，選擇與表型相關(guān)性較大和致病可能性較高的位點(diǎn)進(jìn)行分析，得出結(jié)論。

1.2.4 Sanger測序驗(yàn)證目的基因 對分析獲得的目標(biāo)基因進(jìn)行一代測序驗(yàn)證。運(yùn)用NCBI在線軟件設(shè)計引物。PCR擴(kuò)增后測序獲得家系目標(biāo)基因序列。

2 結(jié) 果

2.1 外顯子捕獲和生物信息學(xué)分析結(jié)果 3個家系檢出異常突變，其中1個家系的突變?yōu)檫z傳性，2個家系胎兒的變異為新發(fā)突變；余3個家系未檢出明確致病突變，其中1個家系檢出2個遺傳性臨床意義不明的突變伴隨子代有一個位點(diǎn)為純合突變。見表1。胎兒2和胎兒3均未檢測到明確致病突變。

2.2 Sanger測序驗(yàn)證 對外顯子捕獲測序檢測的目標(biāo)基因，再對胎兒及父母的基因組DNA標(biāo)本行Sanger測序及驗(yàn)證，結(jié)果與WES結(jié)果一致。見圖2。

表1 胎兒1、4、5、6 Trios-WES檢測結(jié)果

3 討 論

胎兒腎臟囊性病變(renal cystic disease)為常見的胎兒超聲異常，包括單發(fā)性腎囊腫、多發(fā)性腎囊腫、多囊腎、多囊性腎發(fā)育不良等，腎臟的發(fā)育異?？梢怨铝⒋嬖?，也可以合并其他超聲異常。單個囊腫，囊壁光滑，與腎臟集合系統(tǒng)不相連為單發(fā)性腎囊腫[1]。多個囊腫，之間有分隔，囊壁光滑有完整被膜，與腎臟集合系統(tǒng)不相連為腎多發(fā)囊腫。囊腫較大時可引起正常腎組織受壓或萎縮，需手術(shù)治療。嬰兒型多囊腎(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)，為常染色體隱性遺傳，因腎臟皮髓質(zhì)的多發(fā)微小囊腫，超聲探頭發(fā)送的超聲波在囊腫之間的界面反射，導(dǎo)致回聲增強(qiáng)；雙側(cè)腎臟對稱性增大，實(shí)質(zhì)內(nèi)充滿擴(kuò)張的集合管[2]，皮質(zhì)髓質(zhì)界限無法區(qū)分；合并羊水減少時，提示腎功能嚴(yán)重受累，圍產(chǎn)兒預(yù)后差。也可發(fā)生于兒童和成人，起病后通常結(jié)局不好[3]。成人型多囊腎(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一種常染色體顯性遺傳病，表現(xiàn)為腎實(shí)質(zhì)回聲增強(qiáng)，腎區(qū)內(nèi)多個大小不等的囊腫[4-5]，皮髓質(zhì)界限清楚，常有雙親一方多囊腎病史，主要致病基因?yàn)镻KD1和PKD2[6]。當(dāng)腎內(nèi)單側(cè)、雙側(cè)或僅局限于某一部分出現(xiàn)大小不一、數(shù)量不等的囊腔[7]，為多囊性腎發(fā)育不良(multicystic dysplastie kidney disease,MCDK)，又稱多囊泡腎，發(fā)病率約為1/2500，腎內(nèi)大小不等的囊腫互不相通，腎臟體積增大[8]，為胚胎發(fā)育早期輸尿管芽誘導(dǎo)后腎原基發(fā)育過程受阻所致，少數(shù)為遺傳疾病[9]。單側(cè)MCKD，如果羊水量正常，另一側(cè)腎臟超聲影像正常，可在出生后行患側(cè)腎臟切除手術(shù)治療，臨床預(yù)后較好[10]。雙側(cè)腎臟病變時，腎臟體積小、發(fā)育不良，羊水顯著減少甚至無羊水，預(yù)后不良。絕大多數(shù)的MCDK可在產(chǎn)前超聲檢查時診斷[11]。囊性腎病在1986年由Bosniak根據(jù)囊腫的數(shù)目、厚度、有無間隔等特征分為四級[12]。

各種囊性腎病的起病原因不同[13-14]，遺傳性因素為重要的一部分，可能為染色體微缺失微重復(fù)綜合征，也可能為基因水平的致病突變所致。在基因水平，結(jié)合各種測序技術(shù)，已發(fā)現(xiàn)了超過100余種參與囊性腎病的突變基因[15]。

目前檢測囊性腎病致病基因的方法主要有：已知目標(biāo)基因的直接檢測、拷貝數(shù)變異(copy number variant，CNV)檢測、全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)和全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)。當(dāng)一對夫妻因?yàn)橐环交疾』蛟羞^一胎診斷為囊性腎病，可以對先證者進(jìn)行遺傳學(xué)檢測。如果能獲得有意義的檢測結(jié)果，可幫助他們進(jìn)行產(chǎn)前診斷或植入前診斷以得到一個健康的孩子。因?yàn)榇嬖谶z傳異質(zhì)性，該病的致病基因或者致病的染色體的微缺失微重復(fù)很難通過一種傳統(tǒng)的遺傳檢測方法直接找到或者確定。

WES檢測基因組中的編碼區(qū)域，人類外顯子組區(qū)域約占全基因組序列的1%～2%，覆蓋約85%的已知致病基因突變位點(diǎn)[16]。WES既可檢測已知的疾病相關(guān)基因致病位點(diǎn)，又可發(fā)現(xiàn)新的疾病相關(guān)位點(diǎn)和新的疾病相關(guān)基因。外顯子組測序以患者-雙親的核心家系模式為主，有助于提高新發(fā)突變在疾病中的檢出率[17-19]。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)在2020年的規(guī)范中指出產(chǎn)前超聲存在明確結(jié)構(gòu)異常的胎兒，若核型和CMA檢測結(jié)果無異常，推薦核心家系3人組全外顯子組測序(Trio-WES)檢測[20-21]。Petrovski等[21]研究報道，WES在胎兒各個系統(tǒng)包括腎臟系統(tǒng)畸形中有較高的檢出率。相較于一般檢測深度的WGS，WES具有檢測成本較低、對樣本DNA的需求量較小、數(shù)據(jù)信息分析難度較之WGS低以及外顯子區(qū)域測序深度更有保證等優(yōu)勢。在胎兒結(jié)構(gòu)異常其核型和CMA檢測陰性結(jié)果的病例中，WES可額外檢出約10%的致病性基因變異[22-23]。

本研究運(yùn)用WES結(jié)合Sanger測序?qū)MA結(jié)果未見明顯異常的胎兒囊性腎病的6個家系樣本進(jìn)行檢測，旨在單基因水平尋找可能的致病突變。胎兒1 檢測到PKHD1基因存在c.5869G>A和c.9455delA復(fù)合雜合突變，分別遺傳自父親和母親，目前均無相關(guān)文獻(xiàn)報道，在千人基因組和dbSNP 138多態(tài)位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫未見記載，生物信息學(xué)分析表明可能影響PKHD1功能，后者使PKHD1基因的編碼信息發(fā)生錯誤，可能使編碼的蛋白質(zhì)提前終止，從而表達(dá)截短形式的蛋白質(zhì)，根據(jù)胎兒及其父母的檢測結(jié)果，并結(jié)合臨床表現(xiàn)，胎兒的基因型c.5869G>A/c.9455delA，均為可疑致病突變，可能導(dǎo)致多囊腎病，其功能和致病性均需進(jìn)一步驗(yàn)證。胎兒4檢出2個可能與疾病有相關(guān)性的突變：PKHD1基因c.8791C>T突變，1000 Genomes、ExAC和gnomAD人群數(shù)據(jù)庫中均無記載，也未見文獻(xiàn)資料報道，屬于罕見突變。根據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)和指南，評估為臨床意義不明的突變，且僅這一個雜合變異不能導(dǎo)致多囊腎病。PKD1基因第15號外顯子c.5483A>G突變，1000 Genomes、ExAC和gnomAD人群數(shù)據(jù)庫中的發(fā)生頻率分別為0.0002、0.0003和0.0002，在gnomAD人群數(shù)據(jù)庫東亞人群中的發(fā)生頻率為0.003，且僅在東亞人群中發(fā)現(xiàn)，該突變在PKD Mutation Database數(shù)據(jù)庫已收載，臨床意義記錄為不明確，根據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)和指南，評估為臨床意義不明的突變。但胎兒PKD1基因存在c.5483A>G純合突變，而父親為雜合突變，其母親該位點(diǎn)為野生型，胎兒是純合子的現(xiàn)象可能與單親二倍體有關(guān)。故該病例未發(fā)現(xiàn)明確致病的變異。胎兒5HNF1B基因存在c.826C>T雜合突變，為無義突變，可致氨基酸序列發(fā)生p.Arg276X改變，該突變?yōu)橐延袌蟮赖闹虏⌒酝蛔僛24-25]，父母不攜帶，為胎兒新發(fā)突變。胎兒6HNF1B基因存在c.1318G>T雜合，為無義突變，可導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生p.Gly440X改變，評估該突變?yōu)榭赡苤虏⊥蛔?，目前無相關(guān)數(shù)據(jù)庫報道，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為胎兒新發(fā)突變。

胎兒2、3、4檢出的數(shù)據(jù)經(jīng)過詳盡分析后未找到明確致病突變，可能由于WES檢測技術(shù)的局限性、目前數(shù)據(jù)庫積累的數(shù)據(jù)不夠或者生物信息分析方法的不夠完善，也可能需要更新的技術(shù)手段去實(shí)現(xiàn)遺傳性致病因素的檢出，隨著診療技術(shù)日益更新，在不遠(yuǎn)的將來，這些病例可能在更多的平臺去尋找病因。

選擇經(jīng)CMA為陰性結(jié)果的病例，運(yùn)用全外顯子技術(shù)尋找可疑致病位點(diǎn)，隨后一代測序?qū)ν茰y與表型相關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。利用全外顯子組測序分析技術(shù)對先證者進(jìn)行致病基因突變檢測，其靈敏度和特異度均較好。病例中檢出的PKHD1和HNF1B均為已知的可致囊性腎病的基因[26-27]。PKHD1編碼纖維胱氨酸，在腎集合管、膽管、上皮細(xì)胞和胰腺的初級纖毛中表達(dá)。纖維胱氨酸缺乏可導(dǎo)致腎集管和肝內(nèi)膽管的終末分化、擴(kuò)張和纖維化[28]，以致腎臟和肝臟的纖維囊性改變，不同的基因突變位點(diǎn)引起的臨床表現(xiàn)有所不同[29]，至今已經(jīng)報道了750多個PKHD1突變，其中約60%為截斷突變，40%為錯義突變。HNF1B雜合子突變可導(dǎo)致復(fù)雜的綜合征性囊性腎病和糖尿病，其特征是腎臟、尿道、生殖道、膽道和胰腺發(fā)育異?；蚬δ苷系K和糖尿病早發(fā)。導(dǎo)致的腎臟異常包括單側(cè)或雙側(cè)囊腫、多囊發(fā)育不良、發(fā)育不全腎小球囊性腎病等[30]。目前已有超過150個HNF1B雜合突變被報道，包括錯義、無義、插入/缺失、移碼和剪接位點(diǎn)突變以及全基因缺失。本研究3個新的可能致病突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)豐富了這兩個基因的突變譜。越來越多的基因被認(rèn)為與囊性腎病相關(guān)，這個傳統(tǒng)技術(shù)難以解決的問題，很大程度上得益于基于下一代測序的方法，目標(biāo)基因的平行分析大大提高了檢出率。精準(zhǔn)的遺傳學(xué)診斷對遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷都非常重要，為致死性囊性腎病史的家庭提供胚胎移植前診斷的可能性。WES可以將其作為一線檢測手段之一，有利于疾病致病基因庫的建立，為將來基因治療靶向位點(diǎn)建立基礎(chǔ)。

WGS對基因組DNA進(jìn)行檢測，能對外顯子、內(nèi)含子和基因間序列均能覆蓋，但因不同類型胎兒發(fā)育異常的表型基因型數(shù)據(jù)不夠充分，WGS用于產(chǎn)前遺傳學(xué)病因診斷尚待時日。家系WES檢測技術(shù)仍是目前先天性結(jié)構(gòu)異?；颊邔ふ疫z傳性因素的一線選擇。