貝萊斯芽胞桿菌SDTB038與化學(xué)藥劑協(xié)同防治草莓枯萎病的研究

仇 月，孫守民，李鑫榮，楊 帥，王紅艷

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，泰安 271018）

我國(guó)草莓栽培面積大，總產(chǎn)量高[1]。近年來，隨著草莓的種植面積逐漸擴(kuò)大，草莓枯萎病等病害危害加重。草莓枯萎病是由尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporumf. sp.fragariae專化型侵染維管束而導(dǎo)致的系統(tǒng)性土傳病害[2]，在苗期或開花至收獲期發(fā)病。鐮刀菌的防治策略通常依賴于培育無病植株和施用土壤熏蒸劑。但是，培育無病植株費(fèi)時(shí)費(fèi)力，土壤熏蒸成本較高且常造成環(huán)境破壞等問題?；瘜W(xué)殺菌劑對(duì)草莓枯萎病防效較高，但常伴隨著環(huán)境污染、食品安全等問題[3]。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）被認(rèn)為能夠有效減少化學(xué)肥料投入[4]，改善土壤質(zhì)量并增加農(nóng)作物產(chǎn)量[5]。目前，已經(jīng)有許多生防菌被報(bào)道，如蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis[6]、解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens[7]、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌Bacillus methylotrophicus[8]、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis[9]和多粘類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa[10]。生防制劑由于其環(huán)保、安全、方便的特點(diǎn)逐漸被廣大農(nóng)民接受，與化學(xué)藥劑協(xié)同使用也具有廣泛的應(yīng)用前景。生物防治符合我國(guó)植物病蟲害綠色防控的理念，為植物病害防治提供了新方向。

貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis作為一類重要的生物防治資源[11]，可以產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，對(duì)多種真菌和細(xì)菌有較高的抑制活性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的市場(chǎng)前景[12]。目前，尚無貝萊斯芽胞桿菌防治草莓枯萎病的相關(guān)報(bào)道及產(chǎn)品登記。本研究采用課題組分離的貝萊斯芽胞桿菌，與化學(xué)藥劑聯(lián)合使用，驗(yàn)證其協(xié)同防治效果，評(píng)價(jià)生防菌 SDTB038對(duì)草莓枯萎病的防控效果。研究結(jié)果將為利用貝萊斯芽胞桿菌防治植物病害和后續(xù)微生態(tài)制劑的制備奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為生物防治提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

多菌靈、己唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、百菌清、肟菌酯、嘧霉胺和氟醚菌酰胺原藥由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥環(huán)境毒理研究中心提供；草莓枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌?；蚚2]，菌株SDTB038由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供；PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂和1 L去離子水，121 ℃滅菌30 min；LB培養(yǎng)基：1 L去離子水，10 g胰蛋白胨，10 g NaCl，5 g酵母粉，20 g瓊脂粉，121℃滅菌30 min；盆栽試驗(yàn)所用草莓品種為妙香，由泰安市岱岳區(qū)房村鎮(zhèn)種苗供貨商提供。

1.2 菌株SDTB038的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：觀察菌株SDTB038在LB培養(yǎng)基中的形態(tài)特征，使用透射電鏡JEM 1400 plus拍照觀察SDTB038細(xì)胞形態(tài)。

生理生化鑒定：參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]的方法，測(cè)試的生理生化指標(biāo)包括革蘭氏染色，對(duì)不同種類碳源、氮源能否單一利用，硝酸鹽還原反應(yīng)，甲基紅反應(yīng)，V-P反應(yīng)等。試驗(yàn)試劑由南京諾唯贊生物科技有限公司（Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd）提供。

分子生物學(xué)鑒定：使用引物擴(kuò)增菌株SDTB038的16S rRNA和gyrB基因序列[14]，交由生工生物工程（上海）股份有限公司（Angon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.）測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 菌株SDTB038平皿對(duì)峙試驗(yàn)

采用平板對(duì)峙法[12]測(cè)定菌株SDTB038對(duì)草莓枯萎病菌的抑菌效果。將培養(yǎng)5 d的草莓枯萎病菌用打孔器打取菌餅，放置于培養(yǎng)皿中央，將1 μL 108cfu/mL菌液接種于菌餅兩側(cè)，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[15]測(cè)定殺菌劑對(duì)草莓枯萎病菌的室內(nèi)毒力。藥劑設(shè)計(jì)以下濃度梯度（表1），所選藥劑除多菌靈用少量乙酸溶解外，其他藥劑均用少量丙酮溶解，然后用滅菌水配制成1×104mg/L母液備用，并設(shè)置溶劑對(duì)照。25 ℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)5 d后觀察試驗(yàn)結(jié)果。生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

表1 藥劑濃度設(shè)置Table 1 Pesticide concentration settings

1.5 生防菌和化學(xué)藥劑對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響

參照1.3的方法，將病原菌在PDA平板對(duì)峙培養(yǎng)5 d，從距離SDTB038最近的邊緣部位用無菌刀片切取長(zhǎng)為5 mm的菌塊。參照1.4的方法分別制作含肟菌酯和苯醚甲環(huán)唑的PDA平板，倒置培養(yǎng)5 d后，用無菌刀片從菌落邊緣切取長(zhǎng)為5 mm的菌塊。樣品經(jīng)戊二醛和乙酸雙重固定，乙醇系列脫水，并用離子濺射鍍金后放入觀察倉(cāng)進(jìn)行觀察。

1.6 貝萊斯芽胞桿菌SDTB038與化學(xué)藥劑相容性試驗(yàn)

制成含有肟菌酯和苯醚甲環(huán)唑的LB平板，肟菌酯的濃度設(shè)置為10、30、60和90 mg/L；苯醚甲環(huán)唑的濃度設(shè)置為25、50、75和100 mg/L。挑取SDTB038單菌落于液體LB培養(yǎng)基中恒溫過夜培養(yǎng)獲得種子液，將種子液以1%的接種量接種于液體LB中，35 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，用滅菌LB將發(fā)酵液濃度稀釋到10-6。每個(gè)含藥平板涂布100 μL稀釋后的發(fā)酵液，以不含藥劑的LB平板作空白對(duì)照，以含氨芐的LB平板作藥劑對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，記錄單菌落數(shù)。

1.7 貝萊斯芽胞桿菌SDTB038與藥劑混用協(xié)同防治草莓枯萎病

將健康的、長(zhǎng)勢(shì)一致的2葉1心的草莓幼苗移栽于盛有121 ℃高壓滅菌30 min的無菌土的150 mm×130 mm花盆中，每盆1棵草莓苗。試驗(yàn)共設(shè)8個(gè)處理：A：80%多菌靈可濕性粉劑作為藥劑對(duì)照，無菌水配制成350 mg/L，每株噴施10 mL；B：SDTB038發(fā)酵液108cfu/mL，每株灌根處理30 mL；C：40%的苯醚甲環(huán)唑懸浮劑，無菌水配制成20 mg/L，每株噴施10 mL；D：40%的苯醚甲環(huán)唑懸浮劑，無菌水配制成40 mg/L，每株噴施10 mL；E：20 mg/L苯醚甲環(huán)唑，每株噴施10 mL并使用30 mL SDTB038發(fā)酵液108cfu/mL灌根；F：50%的肟菌酯水分散粒劑，無菌水配制成29 mg/L，每株噴施10 mL；G：50%的肟菌酯水分散粒劑，無菌水配制成42 mg/L，每株噴施10 mL；H：29 mg/L肟菌酯，每株噴10 mL并使用30 mL SDTB038發(fā)酵液108cfu/mL灌根。發(fā)酵液施用方法為灌根處理，SDTB038菌液濃度為108cfu/mL。化學(xué)藥劑在灌根后進(jìn)行噴霧處理，著重噴施根莖部位。每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，以滅菌水處理作為陰性對(duì)照。草莓枯萎病的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)以葉片為單位，分為5級(jí)[15]：0級(jí)，無癥狀；1級(jí)，病株有1/4以下的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；2級(jí)，有1/4～1/2的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；3級(jí)，有1/2以上的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；4級(jí)，病株死亡或接近死亡；分別于藥后處理7、14和21 d調(diào)查病情指數(shù)并計(jì)算防治效果，病情指數(shù)＝∑（各級(jí)病葉數(shù)×代表數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高病級(jí)值）×100，防治效果（%）＝∑（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS和Excel軟件，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株SDTB038的鑒定

菌株SDTB038的菌落在LB培養(yǎng)基上（圖1）呈乳白色，凸起，且有規(guī)則的邊緣；生理生化結(jié)果（表2）顯示菌株SDTB038為革蘭氏陽性細(xì)菌，不能夠利用丙二酸，不能夠產(chǎn)生硫化氫氣體和熒光色素；透射電鏡（圖2）結(jié)果顯示SDTB038細(xì)胞為桿狀，有厚厚的莢膜，且周生鞭毛。根據(jù)形態(tài)學(xué)及生理生化特征，對(duì)照細(xì)菌鑒定手冊(cè)和相關(guān)文獻(xiàn)，初步將菌株SDTB038鑒定為芽胞桿菌[12,16]。

圖1 菌株SDTB038菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of strain SDTB038

圖2 25000×透射電鏡菌株SDTB038細(xì)胞形態(tài)Fig. 2 The morphology of strain SDTB038 cell in 25000×transmission electron microscope

表2 菌株SDTB038生理生化指標(biāo)Table 2 Physiological and biochemical indexes of strain SDTB038

菌株SDTB038的16S rRNA（圖3）和gyrB（圖4）基因系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示SDTB038與貝萊斯芽胞桿菌有90%以上一致性。通過上述試驗(yàn)結(jié)果，將菌株SDTB038鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。

圖3 菌株SDTB038的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 The phylogenetic tree of strain SDTB038 16S rRNA sequence

圖4 菌株SDTB038的gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 The phylogenetic tree of strain SDTB038 gyrB gene sequence

2.2 貝萊斯芽胞桿菌SDTB038的抑菌效果

貝萊斯芽胞桿菌 SDTB038對(duì)草莓枯萎病菌有抑制作用（圖5）。

圖5 菌株SDTB038對(duì)草莓枯萎病菌的抑制效果Fig. 5 Inhibitory effect of the strain SDTB038 on F. oxysporum

2.3 室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)

8種不同作用機(jī)制殺菌劑對(duì)草莓枯萎病菌毒力測(cè)定結(jié)果（表3）表明，多菌靈、己唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、百菌清、肟菌酯、嘧霉胺和氟醚菌酰胺的EC50值分別為0.133、4.373、6.729、0.639、3.512、1.949、22.570和18.137 mg/L，其中多菌靈、苯醚甲環(huán)唑和肟菌酯的毒力更高，應(yīng)為備選的高效藥劑。

表3 殺菌劑對(duì)草莓枯萎病的室內(nèi)毒力Table 3 Indoor toxicity of fungicides against F. oxysporum

2.4 生防菌和化學(xué)藥劑對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響

從圖6可以看出，SDTB038處理后的草莓枯萎病菌的菌絲表面有大量細(xì)菌包被（圖6B），病原菌生長(zhǎng)受到明顯的抑制；肟菌酯處理后的菌絲表面有明顯的凹陷（圖6C）；苯醚甲環(huán)唑處理后的菌絲在形態(tài)上發(fā)生分支（圖6D）。

圖6 20000倍掃描電鏡圖Fig. 6 20000×scanning electron microscope

2.5 相容性試驗(yàn)

相容性試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，貝萊斯芽胞桿菌SDTB038分別能夠在10、30、60、90 mg/L肟菌酯和25、50、75、100 mg/L苯醚甲環(huán)唑的含藥平板上正常生長(zhǎng)，含藥平板中的菌落數(shù)目與空白對(duì)照相比沒有明顯差異，且菌落生長(zhǎng)形態(tài)與對(duì)照生長(zhǎng)一致。

表4 菌株SDTB038與化學(xué)藥劑相容性試驗(yàn)Table 4 Compatibility test of strain SDTB038 and chemical pesticides

2.6 貝萊斯芽胞桿菌SDTB038與化學(xué)藥劑協(xié)同防治草莓枯萎病的溫室試驗(yàn)

表5結(jié)果表明，化學(xué)殺菌劑苯醚甲環(huán)唑、肟菌酯分別與貝萊斯芽胞桿菌SDTB038聯(lián)用對(duì)草莓枯萎病有較好的防治效果。施藥后7 d，SDTB038發(fā)酵液處理的防效最低，僅為13.38%。單獨(dú)使用化學(xué)殺菌劑40 mg/L苯醚甲環(huán)唑的防效最高，為56.36%；其次為20 mg/L苯醚甲環(huán)唑與生防菌發(fā)酵液聯(lián)用的防效，為51.17%，并與對(duì)照藥劑350 mg/L多菌靈處理49.79%的防效相當(dāng)；再次分別為42 mg/L肟菌酯處理43.01%的防效及29 mg/L肟菌酯與生防菌發(fā)酵液聯(lián)用40.94%的防效（P＜0.05）。

表5 貝萊斯芽胞桿菌SDTB038與化學(xué)藥劑協(xié)同防治草莓枯萎病的溫室試驗(yàn)防治效果Table 5 Effect of the combination of Fungicide and Bacillus velezensis SDTB038 (108 cfu/mL) on strawberry Fusarium wilt in greenhouse

藥后14 d，所有處理的防效均繼續(xù)提高。其中防效最高的處理為施用40 mg/L苯醚甲環(huán)唑處理的防效以及20 mg/L苯醚甲環(huán)唑與生防菌發(fā)酵液聯(lián)用處理的防效，分別為70.52%和69.48%，兩處理防效相當(dāng)，且顯著高于多菌靈處理的防效；42 mg/L肟菌酯處理的防效及29 mg/L肟菌酯與生防菌發(fā)酵液聯(lián)用的防效均與對(duì)照藥劑多菌靈處理的防效相當(dāng)（P＜0.05）。

藥后21 d，兩種殺菌劑與生防菌聯(lián)用處理的防效仍有明顯提高，持效性較好。20 mg/L苯醚甲環(huán)唑與生防菌聯(lián)用的防效達(dá)74.01%，29 mg/L肟菌酯與生防菌發(fā)酵液聯(lián)用的防效為62.5%，均顯著高于對(duì)照藥劑多菌靈的防效（P＜0.05）。

3 討論

芽胞桿菌是一種重要的生物資源，是最廣泛使用的生物防治劑之一，其生防機(jī)理主要有抗生、競(jìng)爭(zhēng)、促生及誘導(dǎo)抗性（ISR）等[17]。本試驗(yàn)通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子鑒定手段將實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的菌株 SDTB038鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。貝萊斯芽胞桿菌是一種環(huán)境友好的拮抗芽胞桿菌，由于其能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，有效抑制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的多種植物病原菌，防治疫霉菌、茄子根瘤菌和尖鐮孢菌等引起的植物病害，已被廣泛應(yīng)用于生物防治[18]。王雨等[19]報(bào)道了貝萊斯芽胞桿菌HN-2對(duì)杧果炭疽菌有較好抑菌作用的；李生樟等[20]分離鑒定了貝萊斯芽胞桿菌 504對(duì)黃單胞菌屬的細(xì)菌具有較好的抑菌活性；王偉等[21]報(bào)道菌株 X-75對(duì)番茄灰霉病菌灰葡萄孢菌具有明顯的拮抗作用。本研究不僅測(cè)定了貝萊斯芽胞桿菌SDTB038對(duì)草莓枯萎病菌的抑菌活性，還測(cè)定了SDTB038與化學(xué)藥劑聯(lián)合施用的盆栽防治效果，結(jié)果顯示SDTB038菌株在草莓枯萎病防治中具有良好的應(yīng)用前景。

生物防治對(duì)人畜安全、環(huán)境友好且不易引發(fā)抗藥性[21,22]，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，但因其田間效果不穩(wěn)定、藥效發(fā)揮慢、田間防效差等不足嚴(yán)重制約了生防制劑的推廣應(yīng)用[23,24]。研究表明，化學(xué)藥劑能幫助生防菌克服包括病原菌在內(nèi)的習(xí)居微生物的排斥作用，利于其在土壤中順利定殖生存進(jìn)而成為優(yōu)勢(shì)種群，從而發(fā)揮生物防治作用[25-27]。本研究通過室內(nèi)毒力測(cè)定從8種化學(xué)藥劑中篩選出了抑菌效果良好的苯醚甲環(huán)唑和肟菌酯，且生物相容性試驗(yàn)結(jié)果顯示，SDTB038與苯醚甲環(huán)唑、肟菌酯相容性較好，SDTB038在藥劑含量為100 mg/L的平板上仍能正常生長(zhǎng)。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，藥后21 d，29 mg/L肟菌酯與SDTB038協(xié)同防治效果為62.56%，20 mg/L苯醚甲環(huán)唑與SDTB038協(xié)同防治效果為74.01%，顯著高于生防菌及同劑量化學(xué)藥劑單獨(dú)施用的防治效果，與42 mg/L肟菌酯、40 mg/L苯醚甲環(huán)唑的防治效果75.77%和82.82%相近。目前，已有報(bào)道證實(shí)解淀粉芽胞桿菌與氟啶胺復(fù)配對(duì)草莓灰霉病的防效達(dá) 70.21%[25]，枯草芽胞桿菌與吡唑醚菌酯混用對(duì)草莓枯萎病的防效為 72.42%～92.11%[28]，但關(guān)于貝萊斯芽胞桿菌與化學(xué)藥劑聯(lián)合施用的報(bào)道較少，因此，探索SDTB038與化學(xué)藥劑協(xié)同防治草莓枯萎病具有重要意義。

本研究證實(shí)貝萊斯芽胞桿菌 SDTB038發(fā)酵液與化學(xué)藥劑聯(lián)用對(duì)草莓枯萎病有較好的防治效果，能夠減少化學(xué)藥劑肟菌酯和苯醚甲環(huán)唑的用量，也會(huì)顯著降低化學(xué)農(nóng)藥在草莓上的殘留量，對(duì)草莓綠色生產(chǎn)中降低農(nóng)藥殘留量，保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)健康栽培和保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全意義重大。但本試驗(yàn)僅在盆栽試驗(yàn)中進(jìn)行了防效驗(yàn)證，其實(shí)際防治效果仍需要進(jìn)行田間試驗(yàn)。貝萊斯芽胞桿菌 SDTB038具有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值，有潛力將其開發(fā)為一種生物農(nóng)藥或微生態(tài)制劑。本研究將為防治植物病害和后續(xù)微生態(tài)制劑的制備奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為生物防治提供技術(shù)支撐。