煙草尖孢鐮刀菌拮抗真菌的篩選鑒定及促生作用研究

姚晨虓，李小杰，李 琦，邱 睿，白靜科，劉 暢，陳玉國，康業(yè)斌，李淑君*

（1. 河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，洛陽 471023；2. 煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，許昌 461000；3. 中國煙草總公司河南省公司，鄭州 450018）

近年來，煙草鐮刀菌根腐病在我國煙區(qū)的發(fā)病范圍和發(fā)病程度逐步上升[1-3]，在云南[4]、貴州[5]、河南[6]的部分縣（區(qū)）發(fā)生嚴(yán)重；在希臘[7]、西班牙[8]、馬來西亞[9]等國家也均有發(fā)生。據(jù)報(bào)道，引起根腐病的鐮刀菌種類很多，而主要致病菌是尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum和茄病鐮刀菌F. solani[10]。鐮刀菌既可單獨(dú)侵染，又可與煙草疫霉、根結(jié)線蟲等混合侵染，造成煙株死亡，煙葉大幅減產(chǎn)，甚至絕收，已成為嚴(yán)重危害煙草的根莖類病害之一[11]。

目前，以生物農(nóng)藥為主的煙草病害生物防治技術(shù)的研究與應(yīng)用已成為熱點(diǎn)，對(duì)煙草行業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。劉暢等[12]研究了哈茨木霉YCG-2對(duì)煙草黑脛病具有較強(qiáng)的拮抗作用。陳小均等[5]報(bào)道木霉菌肥對(duì)土壤優(yōu)勢(shì)真菌和煙草茄病鐮刀菌有較好的防病和治療作用。田艷艷等[13]報(bào)道哈茨木霉和棘孢木霉對(duì)煙草疫霉、瓜果腐霉和尖孢鐮刀菌均有一定的抑制作用。姚曉遠(yuǎn)等[14]報(bào)道了哈茨木霉對(duì)煙草茄病鐮刀菌有較好的防治效果。但對(duì)煙草尖孢鐮刀菌拮抗真菌的系統(tǒng)篩選及其作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。

因此，本研究通過對(duì)植物根際土壤微生物的分離、篩選，獲得對(duì)煙草尖孢鐮刀菌具有較好抑制作用的拮抗真菌菌株，明確其種類，并測定其對(duì)煙草的促生效果，為進(jìn)一步研制高效生防菌劑和生物菌肥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土樣 2020年分別選取許昌、漯河、平頂山等豫中煙區(qū)，在煙草團(tuán)棵期至旺長期采集煙田及其鄰近田塊植株根際土壤。

1.1.2 供試菌株和煙草品種 供試煙草病原菌由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所菌源庫提供；煙草品種為“中煙100”（中抗）[10]，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所種質(zhì)資源庫提供。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 土壤真菌分離純化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），在相對(duì)濕度70%，25 ℃光周期12L﹕12D的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5 d，將純化的菌株于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗真菌分離純化 將取回的根際土壤樣品自然風(fēng)干并挑除雜物，過篩后用四分法收集。采用梯度稀釋涂布平板法，用無菌水制成10-1、10-2、10-3的土壤懸浮液，分別取100 μL均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)真菌菌落，挑取不同形態(tài)、顏色、大小的菌落進(jìn)行純化保存。

1.2.2 拮抗真菌的篩選 以煙草尖孢鐮刀菌為靶標(biāo)，在活化好的菌落外圍打取直徑5 mm菌餅，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法和菌絲生長速率法[13]在距離PDA平板中心2.5 cm的相對(duì)2點(diǎn)上分別接種純化待測真菌和病原菌，以只接病原菌為對(duì)照，重復(fù)3次。倒置放入25 ℃恒溫光照箱培養(yǎng)6～8 d后采用十字交叉法測量菌絲半徑，計(jì)算菌絲生長抑制率[13]。以距中心2.5 cm的相對(duì)2點(diǎn)上接種待測真菌，中心位置接種病原菌進(jìn)行復(fù)篩，其他方法同上并計(jì)算抑制率，抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

真菌拮抗系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[15]：Ⅰ級(jí)：待測真菌菌絲平板覆蓋率 100%；Ⅱ級(jí)：待測真菌菌絲平板覆蓋率2/3以上；Ⅲ級(jí)：待測真菌菌絲平板覆蓋率1/3～2/3；Ⅳ級(jí)：待測真菌菌絲平板覆蓋率1/3以下；Ⅴ級(jí)：病原菌絲平板覆蓋率100%。

1.2.3 拮抗真菌的鑒定 選取已純化的待測菌株，制作不同生長時(shí)期的水玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢方式和子實(shí)體的形態(tài)、大小、顏色，根據(jù)觀察到的形態(tài)特征參照《真菌鑒定手冊(cè)》[16]等相關(guān)文獻(xiàn)資料，初步確定菌株的分類地位。

參照文獻(xiàn)方法[17]使用 Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工），提取待測菌株的基因組DNA，應(yīng)用真菌鑒定通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系（25 μL）：DNA 模板 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，2×PCRTaqMasterMix 12.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后送至上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成測序。應(yīng)用NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)分析，采用MEGA軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 拮抗菌株的抑菌譜測定 方法同 1.2.2，測定所鑒定菌株對(duì)煙草茄病鐮刀菌F. solani、疫霉菌Phytophthora nicotianae、根串珠霉菌Thielaviopsis basicola、鏈格孢菌Alternaria alternata、擬莖點(diǎn)霉Phomopsissp.、煙草炭疽菌Colletotrichum nicotianae、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothide8種煙草病害的抑制效果。

1.2.5 拮抗菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)及促生作用測定 采用培養(yǎng)皿濾紙保濕法[17]，將“中煙100”種子依次用75%的乙醇和0.5%的次氯酸鈉消毒30 s，無菌水漂洗干凈后放入拮抗菌孢子懸浮液（濃度為 1×107孢子/mL）中浸種16 h，再用無菌水漂洗3～4次，晾干，將種子整齊擺放在無菌脫脂棉和濾紙保濕的培養(yǎng)皿中，以無菌水浸泡同等時(shí)間的消毒種子作為對(duì)照，每皿25粒種子（5×5），重復(fù)3次，第13 d測量統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率及煙苗根長，計(jì)算增長率，增長率（%）＝（處理組根系長度－對(duì)照組根系長度）對(duì)照組根系長度×100。

1.2.6 拮抗菌株對(duì)煙草盆栽促生作用測定 采用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)法[17]并略有改動(dòng)，將未經(jīng)處理的“中煙100”種子培育至4～5片真葉期，將滅菌的基質(zhì)和土均勻混合（質(zhì)量比2:1）、拌至濕度適宜，每個(gè)盆缽（口徑9.3 cm，底徑7.0 cm，盆高7.5 cm）中裝（180±2.5）g基質(zhì)土，挑選大小均一的煙苗移栽至盆缽中，將培養(yǎng)好的拮抗菌發(fā)酵液（挑取12個(gè)活化培養(yǎng)好的5 mm拮抗菌菌柄，在無菌環(huán)境下轉(zhuǎn)接至裝有200 mL液體PDA培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d制成）稀釋至1×107孢子/mL的濃度，按每株20 mL進(jìn)行灌根處理，每處理10株盆栽，重復(fù)3次，以等體積無菌水灌根處理為對(duì)照，期間保證水肥管理統(tǒng)一，第25 d根據(jù)中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YC/T142-2010）中的農(nóng)藝性狀測量方法測定其對(duì)農(nóng)藝性狀的影響，測量指標(biāo)包括煙株的株高、莖圍、有效葉片數(shù)、最大葉長、最大葉寬、地上鮮重和根系鮮重，并利用下列公式計(jì)算最大葉的葉面積，葉面積（cm2）＝0.6345×葉長（cm）×葉寬（cm）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用DPS 7.05 軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗真菌的分離篩選

分離純化真菌菌株371株。通過平板對(duì)峙培養(yǎng)法獲得1株對(duì)尖孢鐮刀菌具有明顯抑制效果的真菌菌株（圖1），編號(hào)為Tr-0111，初篩抑制率為76.12%，拮抗系數(shù)為Ⅱ級(jí)；復(fù)篩抑制率為93.13%，拮抗系數(shù)為Ⅱ級(jí)（表1）。

圖1 菌株Tr-0111對(duì)尖孢鐮刀菌的PDA平板抑制作用Fig. 1 The inhibitory effect of strain Tr-0111 on PDA plate of F. oxysporum

表1 菌株Tr-0111對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用Table 1 The inhibitory effect of strain Tr-0111 on F. oxysporum

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株Tr-0111菌落初期為白色，中心淺綠色，氣生菌絲纖細(xì)、羊毛狀，由中心向四周散布，菌落背面無色。菌落中期逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇\綠色，中心呈深綠色，氣生菌絲轉(zhuǎn)變?yōu)槊扌鯛?。菌落后期整體呈深綠色，棉絮狀菌絲減少，菌落背面淺綠色至綠色（圖2）。分生孢子梗主枝呈樹狀，含多級(jí)分枝，各級(jí)分枝的頂端形成 3個(gè)簇生的小梗，分生孢子呈球形、橢球形或卵形，淺綠色，初步鑒定為木霉屬Trichodermaspp.[16]真菌（圖3）。

圖2 菌株Tr-0111在PDA培養(yǎng)基上1～6 d (a-f)的菌落形態(tài)Fig. 2 Colonial morphology of strain Tr-0111 on PDA medium for 1-6 d (a-f)

圖3 菌株Tr-0111的顯微形態(tài)Fig. 3 Microscopic morphology of strain Tr-0111

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 將菌株 Tr-0111的 ITS序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得大小為 577 bp的特異性條帶（GenBank登錄號(hào)：MZ 818342），在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)菌株Tr-0111與棘孢木霉菌相似性可達(dá)100%。運(yùn)用鄰接法構(gòu)建該菌株的18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果表明該菌株與棘孢木霉菌（MN093873.1、MT102261.1、MG786721.1）以 100%自舉值聚于同一分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株Tr-0111鑒定為棘孢木霉T. asperellum。

圖4 菌株Tr-0111的18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 The phylogenetic tree of strain Tr-0111 18S rDNA sequence

2.3 拮抗菌株對(duì)煙草病原的抑菌譜

抑菌譜測定結(jié)果表明，菌株Tr-0111對(duì)其他8種煙草病害的病原菌均有不同程度的抑制作用（圖5）。其中對(duì)根串珠霉菌的抑制效果最為顯著，抑制率為90.11%，拮抗系數(shù)為Ⅰ級(jí)；對(duì)立枯絲核菌的抑制作用相對(duì)較弱，抑制率也達(dá)42.67%，拮抗系數(shù)為Ⅲ級(jí)（表2）。表明菌株Tr-0111對(duì)煙草病原菌的防治具有非常好的廣譜性。

表2 菌株Tr-0111對(duì)常見煙草病原菌的抑制作用Table 2 The inhibitory effect of strain Tr-0111 on common tobacco pathogens

2.4 拮抗菌株對(duì)煙草種子萌發(fā)及促生作用

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株Tr-0111孢子懸浮液處理過的種子與無菌水處理過的對(duì)照組種子相比，萌發(fā)率提高了5.34%，處理組種子萌發(fā)率可達(dá)90.67%，且存在顯著性差異（表3）。處理組的煙苗根系發(fā)育較好，長勢(shì)一致且根長明顯長于對(duì)照組，煙苗根長增長率為62.39%，存在極顯著差異水平（圖6）。

表3 菌株Tr-0111孢子懸浮液對(duì)煙草種子萌發(fā)和根系發(fā)育的影響Table 3 Effects of spore suspension of strain Tr-0111 on tobacco seed germination and root development

2.5 拮抗菌株對(duì)煙草盆栽促生作用

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株Tr-0111發(fā)酵液灌根的煙苗與對(duì)照組煙苗在農(nóng)藝性狀的各項(xiàng)指標(biāo)中均存在一定的差異，處理組的煙草長勢(shì)一致，枝葉繁茂，根系發(fā)達(dá)，整體促生效果良好，尤其在最大葉面積和地上鮮重部分，最大葉面積增加了55.13 cm2，地上鮮重增加了9.49 g，兩者均與對(duì)照組存在顯著差異（表4）。

表4 菌株Tr-0111發(fā)酵液對(duì)盆栽煙草的促生效果Table 4 Growth-promoting effect of fermentation broth of strain Tr-0111 on potted tobacco

3 討論

煙草鐮刀菌根腐病的化學(xué)防治不僅對(duì)非靶標(biāo)生物有害且存在殘留問題，農(nóng)業(yè)防治費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而生物防治可以極大程度上降低化學(xué)藥劑用量且不會(huì)損害到非靶標(biāo)生物[18-20]。木霉屬真菌是研究最多、應(yīng)用最廣的一類生防真菌，具有極高的生防價(jià)值[21]。目前，關(guān)于棘孢木霉在不同作物上的防病效果和促生作用也常有報(bào)道。劉暢等[22]報(bào)道棘孢木霉CBS 433.97對(duì)尖孢鐮刀菌MC-1（苦瓜枯萎病病原菌）和CS-5（黃瓜枯萎病病原菌）的抑制率分別為36.4%和62.0%；鄭柯斌等[23]報(bào)道了海洋生境棘孢木霉TCS007對(duì)16種植物病原菌的抑制率在56.65%～87.62%。而本研究篩選鑒定的棘孢木霉Tr-0111對(duì)煙草尖孢鐮刀菌的抑制效果明顯更強(qiáng)，對(duì)煙草茄病鐮刀菌和其他常見病原菌均有極好的抑制效果，同樣也證實(shí)了棘孢木霉具有極好的廣譜性。平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，煙草尖孢鐮刀菌的平板抑制效果與棘孢木霉 Tr-0111的接種量成正相關(guān)，復(fù)篩抑菌率較初篩抑菌率提高了17.01%，最高可達(dá)93.13%，對(duì)于盆栽防效和田間試驗(yàn)而言，可通過調(diào)節(jié)生防菌劑的施用量以期達(dá)到最佳的防治效果，具有較高的生防潛力和應(yīng)用價(jià)值。

自1998年桑維鈞等[24]首次報(bào)道我國煙草鐮刀菌根腐病以來，相關(guān)研究較少，尤其對(duì)煙草病害生防菌的促生作用更是鮮有報(bào)道[5,13,14,25]。本研究采用培養(yǎng)皿濾紙保濕法測定了棘孢木霉Tr-0111處理過的煙草種子萌發(fā)率和根系生長均顯著提高，操作方便快捷，影響因素單一，直觀的篩選并反映了對(duì)煙草尖孢鐮刀菌具有極好的抑制作用，兼具促生效果的高效拮抗菌株，對(duì)生產(chǎn)上抗性品種的誘導(dǎo)選育、包衣劑的開發(fā)具有很好的應(yīng)用前景。

張曉夢(mèng)等[26]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉 M2對(duì) 8種植物病原菌均有較好的抑制能力，并且可以促進(jìn)植物生長；Yu等[27]報(bào)道棘孢木霉TaspHu1孢子懸浮液處理的番茄幼苗的株高、莖圍、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量均明顯增高，同時(shí)增強(qiáng)了番茄幼苗對(duì)鏈格孢的抗性。本研究也證實(shí)了棘孢木霉Tr-0111的發(fā)酵液對(duì)煙草幼苗的各項(xiàng)農(nóng)藝性狀指標(biāo)有明顯的提升，對(duì)于植株本身抗性酶活和不同激素水平的影響需要進(jìn)一步驗(yàn)證，并繼續(xù)挖掘其促生原理和抗病機(jī)制。

本研究通過大量分離、篩選，鑒定出一種對(duì)煙草尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)抑制作用，抑菌譜廣，且能促進(jìn)煙草種子萌發(fā)和植株生長的棘孢木霉 Tr-0111，具有極好的研究價(jià)值和生防應(yīng)用潛力，為下一步的相關(guān)研究和生產(chǎn)應(yīng)用工作的開展奠定基礎(chǔ)。