楊浦鏈霉菌WLU210的篩選、鑒定及其對苦瓜枯萎病的生防作用研究

張 涵，習慧君，趙玉華，萬鑫茹，張園園，趙 瑩，文才藝

（河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，鄭州 450002）

苦瓜是我國重要的食用蔬菜之一，具有清爽的口感和良好的藥用價值[1]。近年來，由于苦瓜種植面積不斷擴大，重茬連作現(xiàn)象普遍，導致苦瓜枯萎病的發(fā)生和為害逐年加重，一般發(fā)病率為15%～25%，嚴重時高達60%～80%，甚至造成大面積絕收，嚴重影響苦瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。

目前，生產(chǎn)上對苦瓜枯萎病的防治主要以抗病品種選育與利用和化學防治為主。利用抗病品種來防治病害雖然經(jīng)濟有效，但由于目前生產(chǎn)上的苦瓜品種多為中抗或感病品種，高抗或免疫的品種缺乏，且新的抗性品種選育周期長，難以滿足現(xiàn)實生產(chǎn)的需求[3-5]。化學防治作為植物病害防治的主要措施，具有見效快和適應性強等優(yōu)點，但由于苦瓜枯萎病為典型的土傳病害，防治難度大，多數(shù)化學藥劑防治效果不佳。生產(chǎn)中，為了控制這種病害，常常使用化學農(nóng)藥灌根或處理土壤，容易導致農(nóng)藥殘留、破壞土壤微生態(tài)環(huán)境和引發(fā)病原菌產(chǎn)生抗性等問題[6]；生物防治對環(huán)境兼容性好，方便與農(nóng)業(yè)防治措施配合使用而達到可持續(xù)控制枯萎病的目的。因此，已成為目前苦瓜生產(chǎn)上，尤其是設施栽培中重要的防控措施。在苦瓜枯萎病生物防治研究方面，生防真菌和細菌的研究報道較多，如木霉Trichodermaspp.[7-9]、綠針假單胞菌Pseudomonas choloeaphtis[10]和多黏類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa[11]等，有關生防放線菌防治苦瓜枯萎病的研究報道較少。李曉芳等[12]從健康苦瓜根際分離獲得一株生防鏈霉菌，可通過抑制土壤中尖孢鐮孢菌的數(shù)量來防治病害，對苦瓜枯萎病的田間防效達到62.1%。我們從河南黃河濕地土壤樣品分離獲得一株對苦瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumf. sp.momordicae具有穩(wěn)定拮抗活性的放線菌菌株WLU210，為了評估該菌株的生防潛力，本研究對該菌株分類鑒定、拮抗活性和生防效果進行了系統(tǒng)研究，以期為苦瓜枯萎病的生物防治提供有效的放線菌資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品 2017年5—7月分別從河南省鄭州市、洛陽市、開封市和三門峽市的黃河濕地采集土壤樣品共24份，供放線菌分離、篩選使用。

1.1.2 放線菌分離培養(yǎng)基 培養(yǎng)基M1-M8的配制參考文獻[13-15]。

1.1.3 培養(yǎng)基 Potato Dextrose Agar（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

1.1.4 苦瓜品種 如玉33號，購置于福建農(nóng)科農(nóng)業(yè)良種開發(fā)有限公司。

1.1.5 供試植物病原菌 苦瓜枯萎病菌F. oxysporumf. sp.momordicae、蘋果輪紋病菌Botryosphaeria dothidea、小麥莖基腐病菌Fusarium pseudograminearum、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici、西瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare、小麥全蝕病菌Gaeumannnomyces graminisvar. tritici和玉米大斑病菌Setosphaeria turcica由河南農(nóng)業(yè)大學植物病害生物防治實驗室分離保存。

1.1.6 其他 試驗所用藥劑為50%多菌靈可濕性粉劑，購置于豫玉種業(yè)公司。

1.2 土壤放線菌的分離、純化

稱取2 g土壤樣品溶于18 mL無菌水中，在180 r/min的搖床上振蕩3 h后靜置，吸取上清液制成10-1g/mL濃度土壤懸浮液，依次進行梯度稀釋。分別吸取200 mL稀釋度為10-3、10-4的土壤懸浮液到分離培養(yǎng)基（M1-M8）平板上，每個梯度重復3次，用無菌涂布棒均勻涂布，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待培養(yǎng)5～7 d后觀察菌落生長情況，用接種環(huán)挑選單菌落至高氏1號培養(yǎng)皿上純化培養(yǎng)，并根據(jù)菌落形態(tài)特征和樣品來源對分離得到的放線菌菌株去重復，將去重后的菌株用25%甘油在-80 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.3 拮抗菌株的篩選

1.3.1 拮抗菌株的初篩 以苦瓜枯萎病菌等7種植物病原菌為靶標菌進行拮抗放線菌篩選。將靶標菌菌餅（d＝5 mm）接種于直徑為9 cm的PDA平板中央，在菌餅四周3 cm處接種不同放線菌菌株，于28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)5～6 d后，觀察并記錄抑菌效果。

1.3.2 拮抗菌株復篩 以苦瓜枯萎病菌為靶標，對初篩得到的放線菌菌株進行復篩。將苦瓜枯萎病菌菌餅（d=5 mm）接種于直徑為9 cm的PDA平板中央，在菌餅兩邊3 cm處劃線接種相同菌株，以僅接種苦瓜枯萎病菌為空白對照，測定不同菌株對苦瓜枯萎病菌的抑菌效果，從中挑選抑菌效果最佳的菌株作為候選菌株進行后續(xù)試驗。

1.3.3 菌株WLU210拮抗譜的測定 分別以蘋果輪紋病菌、小麥莖基腐病菌、辣椒疫霉病菌、西瓜炭疽病菌、小麥全蝕病菌和玉米大斑病菌為靶標菌，按照1.3.1的方法與菌株WLU210進行對峙培養(yǎng)，觀察并記錄抑菌效果。

1.4 菌株WLU210的分類鑒定

1.4.1 形態(tài)特征觀察 采用插片法觀察菌株的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子形態(tài)。菌株WLU210劃線培養(yǎng)于高氏1號平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)5和9 d后取樣，用掃描電鏡（日立S4800）觀察、拍照。

1.4.2 生理生化特征測定 參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]中描述的方法測定菌株WLU210對不同碳源和氮源的利用情況、還原硝酸鹽、亞硝酸的能力、分解纖維素和淀粉的能力、液化明膠和產(chǎn)H2S的情況等。

1.4.3 16S rRNA基因序列分析 采用CTAB法[18]提取菌株的總DNA，PCR擴增引物為27F（5′-AGAGTT TGATCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）；PCR 擴增體系（25 μL）：2×EasyTaqMaster Mix 12.5 μL，DNA 模板 1 μL，10 μmol/L 引物各 0.5 μL，ddH2O 補足 25 μL；程序為94 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。將擴增得到的產(chǎn)物送往上海生物工程技術(shù)服務有限公司測序。測序完成后將得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，選取與其相似度較高的基因序列，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 生防放線菌對苦瓜的促生和防病效果

1.5.1 菌株WLU210對苦瓜的促生效果測定 將菌株WLU210接種于100 mL高氏1號液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng) 5～7 d后，發(fā)酵液用無菌濾膜過濾，濾液用滅菌的高氏 1號液體培養(yǎng)基稀釋，得到WLU210孢子懸浮的濃度為106孢子/mL，待苦瓜幼苗長出兩片真葉時，將制備好的WLU210孢子懸浮液按每株10 mL進行灌根接種；以接種高氏1號液體培養(yǎng)基為對照，處理后的苦瓜苗在28 ℃～30 ℃溫室中培養(yǎng)，30 d后調(diào)查統(tǒng)計苦瓜株高、地上部分鮮重、根長和根鮮重等生理指標。

1.5.2 菌株WLU210對苦瓜枯萎病防治效果的盆栽試驗 將苦瓜種子催芽后在室溫內(nèi)播種，待苦瓜幼苗長出兩片真葉時進行灌根接種。菌株WLU210發(fā)酵液的制備按1.5.1所述。試驗設置對照組和處理組，對照組：在苦瓜根部接種10 mL滅菌的高氏1號液體培養(yǎng)基，1 d后再接種10 mL病原菌孢子懸浮液（孢子懸浮液的濃度為106孢子/mL）至苦瓜根部；處理組：用10 mL WLU210發(fā)酵液對瓜根部進行灌根接種，1 d后再接種病原菌孢子懸浮液（孢子懸浮液的濃度為106孢子/mL）。所有處理的苦瓜幼苗置于28 ℃～30 ℃溫室中培養(yǎng)，待對照組發(fā)病后，統(tǒng)計試驗結(jié)果并拍照。試驗重復3次，每處理8株苦瓜幼苗。

1.6 菌株WLU210對苦瓜枯萎病防治效果的田間試驗

試驗于2019年4月—2019年7月在河南農(nóng)業(yè)大學原陽試驗基地的苦瓜枯萎病病圃中進行。試驗設置對照（CK）、生防菌處理和農(nóng)藥處理3個小區(qū)，每個小區(qū)25 m2，3個重復，共9個小區(qū)。對照小區(qū)常規(guī)管理；生防菌處理小區(qū)于苦瓜定植時穴施WLU210孢子懸液40 mL（孢子濃度為106孢子/mL），定植21 d后，用相同濃度的WLU210孢子懸液灌根處理，每株20 mL；農(nóng)藥處理小區(qū)于苦瓜定植時穴施50%多菌靈500～600倍液40 mL，定植21 d后，用相同濃度的多菌靈500～600倍液灌根處理，每株20 mL。根據(jù)田間苦瓜枯萎病發(fā)病等級分級標準[19]，在苦瓜種植后35和56 d時調(diào)查各小區(qū)發(fā)病情況，統(tǒng)計病情指數(shù)，計算生防菌株的田間防效。病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的篩選

從河南省不同地區(qū)黃河濕地土樣中共分離獲得土壤放線菌330株，通過平板對峙法對分離獲得的土壤放線菌進行篩選，獲得13株對苦瓜枯萎病菌具有抑菌效果的拮抗菌株。初篩和復篩結(jié)果顯示，菌株WLU210對苦瓜枯萎病菌的抑菌效果最佳，抑菌率為60.64%（圖1），因此選定菌株WLU210進行后續(xù)研究。

圖1 菌株WLU210對苦瓜枯萎病菌的抑菌效果Fig. 1 Inhibition activity of strain WLU210 to F. oxysporum f. sp. momodicae

2.2 菌株WLU210的拮抗譜

試驗結(jié)果表明，菌株WLU210除了對苦瓜枯萎病菌具有良好的拮抗活性外，對供試的6種植物病原菌均具有較強的拮抗活性（圖2）。

圖2 菌株WLU210的拮抗譜Fig. 2 Antagonistic spectrum of strain WLU210

2.3 菌株WLU210的分類鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株WLU210形態(tài)學特征 菌株WLU210在高氏1號培養(yǎng)基上生長良好，單菌落呈圓形點狀，氣生菌絲為淺灰色，基內(nèi)菌絲為象牙色，無可溶性色素產(chǎn)生（圖3a）。菌株基內(nèi)菌絲無隔膜，不斷裂；孢子絲以橫割分裂的方式形成孢子（圖3b），孢子呈圓柱狀，表面光滑（圖3c）。

圖3 菌株WLU210的形態(tài)特征Fig. 3 Morphological characteristics of strain WLU210

2.3.2 菌株WLU210的生理生化特征 菌株WLU210的生理生化特征測定結(jié)果如表1所示：菌株WLU210能夠利用葡萄糖、蔗糖和麥芽糖為碳源，可以利用甘氨酸和精氨酸為氮源，可以分解纖維素、水解淀粉、液化明膠、但不產(chǎn)生H2S。在利用碳源方面，除了利用蔗糖的差異外，菌株WLU210與菌株楊浦鏈霉菌S.yangpuensisfd2-tbT（GenBank accession numbers，KP893387）[20]完全一致。

表1 菌株WLU210的生理特征測定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain WLU210

2.3.3 菌株WLU210的16S rRNA基因序列分析結(jié)果 菌株WLU210的16S rRNA基因序列長度為1394 bp（GenBank登錄號：MG856016），將該序列在NCBI上進行BLAST檢索，選取與其同源性較高的菌株序列進行建樹比對結(jié)果所示，菌株WLU210與楊浦鏈霉菌親緣關系較近，同源性達到100%（圖4）。綜合形態(tài)學、生理生化特征和16S rRNA序列分析比對，將菌株WLU210鑒定為楊浦鏈霉菌。

圖4 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strain WLU210 based on 16S rRNA gene sequences

2.4 菌株WLU210對苦瓜的促生作用

菌株 WLU210對苦瓜地上部分的促生效果明顯，株高和地上部分鮮重分別比對照提高了 73.31%和65.00%；與相比對照，根鮮重增加了14.00%（表2）。

表2 菌株WLU210對苦瓜的促生作用Table 2 Plant growth promoting effect of strain WLU210 on bitter gourd

2.5 菌株WLU210對苦瓜枯萎病的室內(nèi)生防效果

苦瓜接種處理21 d后，只接種苦瓜枯萎病菌的對照組苦瓜出現(xiàn)葉片黃化，植株萎蔫等苦瓜枯萎病典型癥狀；經(jīng)過生防菌處理后再接種病原菌的苦瓜長勢良好，未出現(xiàn)苦瓜枯萎病癥狀。表明菌株WLU210對苦瓜枯萎病具有一定的生防效果（圖5）。

圖5 菌株WLU210的盆栽生防效果圖Fig. 5 Biocontrol effect of strain WLU210 in pot experiments

2.6 田間小區(qū)試驗結(jié)果

苦瓜旺長期，生防菌WLU210的防治效果為58.86%，隨著病情的發(fā)展，生防菌WLU210的防治效果逐漸增加，至坐果期時，防治效果達到69.89%，與化學農(nóng)藥多菌靈的防治效果相當（表3）。結(jié)果表明，生防菌WLU210對苦瓜枯萎病有持續(xù)的防治效果。

表3 田間試驗結(jié)果Table 3 Biocontrol effect of strain WLU210 against Fusarium wilt of bitter gourd in field trial（2019.6.25～7.16）

3 討論

放線菌是重要的植物病害生物防治微生物資源，其中，鏈霉菌屬Streptomyces及其相關類群是用于植物病害生物防治的主要放線菌類群[21]。在植物枯萎病生物防治方面，已報道的生防鏈霉菌包括弗氏鏈霉菌S.fradiae[22]、毒三素鏈霉菌S.toxytricini[23]、黃麻鏈霉菌S.corchorusii[24]、婁徹氏鏈霉菌S.rochei[25]、利迪鏈霉菌S.lydicus[26]等。隨著可培養(yǎng)放線菌篩選工作的廣泛開展，加之在篩選過程中普遍使用傳統(tǒng)的菌種分離和鑒定技術(shù)，導致大量已知的普通分離菌株被重復分離和使用，因此，從一般生境中獲取放線菌新物種或新活性物質(zhì)的幾率越來越小[27]。近年來，從海洋[28]、荒漠[29]和濕地[30]等特殊生境發(fā)掘新型放線菌資源已成為研究的熱點。王皓等[31]從海洋生境中篩選出多株對黃瓜枯萎病具有較好防治效果的拮抗鏈霉菌。我們的前期研究工作表明，河南黃河濕地具有豐富的放線菌資源，且代謝途徑多樣，具有發(fā)掘放線菌新物種和新型活性物質(zhì)的潛力[32]。基于此，本研究從河南黃河濕地分離的330株可培養(yǎng)放線菌中獲得13株對苦瓜枯萎病菌具有拮抗效果的放線菌菌株，其中，具有生防應用潛力的菌株WLU210被鑒定為楊浦鏈霉菌。

楊浦鏈霉菌是鏈霉菌屬的一個新種，由Tang等[20]于2016年首次分離、鑒定。我們首次從黃河濕地生境分離到楊浦鏈霉菌WLU210，盆栽試驗結(jié)果顯示，楊浦鏈霉菌WLU210可以有效促進苦瓜生長，尤其是對苦瓜株高和地上部分鮮重的促生效果最顯著，同時對苦瓜枯萎病具有良好的防治效果；田間試驗結(jié)果顯示，菌株 WLU210處理后，苦瓜枯萎病的發(fā)病率和平均病情指數(shù)與對照相比，均顯著降低，防治效果達69.89%。由此可見，作為苦瓜枯萎病生物防治的新型菌種資源，楊浦鏈霉菌WLU210具有良好的研發(fā)和應用潛力，有關該菌株對苦瓜枯萎病的生防機理還有待進一步研究。