基于間斷化學(xué)分析儀的茶多酚測(cè)定方法研究

劉華豐

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

茶多酚是茶葉主要的保健功效成分之一[1,2]，屬于多酚類物質(zhì)，不同茶葉中茶多酚總量差別較大[3]，一般來說，普洱熟茶含量最低，一般在6%～12%之間，綠茶含量最高，干物質(zhì)占比可達(dá)到30%～36%以上。

目前，國(guó)標(biāo)檢測(cè)茶多酚的方法主要是福林酚分光光度法，涉及的標(biāo)準(zhǔn)包括GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[4]和GB/T 31740.2—2015《茶制品 第2部分：茶多酚》[5]附錄A方法。福林酚法準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、適用范圍廣，但檢測(cè)比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

1 材料與方法

1.1 原理

茶葉經(jīng)磨碎過篩后，用70%甲醇提取，經(jīng)稀釋后在堿性條件下與福林酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽反應(yīng)，產(chǎn)生深藍(lán)色鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物。在一定的吸收波長(zhǎng)下，藍(lán)色深度與茶多酚含量成正比，用沒食子酸作校正曲線，定量茶葉中的茶多酚含量。

1.2 儀器

間斷化學(xué)分析儀：CleverChem380（德國(guó)DeChem-Tech.GmbH，精度：0.0001 Abs）；

電子分析天平：d=0.0001 g，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；

精密水浴鍋：0～14500 r/min；

紫外可見光光度計(jì)：UV-2700，日本島津公司（KYOTO），185～900 nm（精度：0.1 nm）

1.3 試劑

70% （體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液、碳酸鈉溶液（7.5%）、福林酚溶液（10%，體積分?jǐn)?shù)）。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

各向同性材料：本身具有各向同性屬性的原料，多種物料均勻混合，各微小顆粒體雖然具有各向異性屬性，但由于大量微小顆粒的隨機(jī)分布，可以將其均勻混合物近似視為各向同性材料。配合飼料雖然由玉米等大量各向異性原料微?；旌隙?，但由于大量微粒的隨機(jī)分布和排列，可將?？字械奈锪项w粒近似視為各項(xiàng)同性材料(武凱等，2013)。各向同性材料其實(shí)是橫觀各向同性材料的特殊情況。

稱取0.2 g（精確到0.0001 g）經(jīng)均勻磨碎后的試樣，放入10 mL離心管中，用70 ℃甲醇水溶液（70%）浸提10 min，每隔5 min渦旋一次，冷卻后以4000 r/min離心5 min，取出上清液，殘?jiān)郎喜襟E再浸提一次，合并上清液，用甲醇水溶液定容至10.0 mL，用0.45 μm有機(jī)膜過濾。取濾液1.00 mL，用三級(jí)水定容至100 mL，待測(cè)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作也的配制

稱取0.110 g 沒食子酸（GA，相對(duì)分子量188.14），溶解并定容至100 mL，得1.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再取5.00 mL儲(chǔ)備溶液，稀釋定容至100 mL，得50.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液.

1.4.3 茶多酚含量測(cè)定

取沒食子酸工作溶液（分別按1∶20、1∶10、1∶5、1∶4、1∶2、1∶1稀釋）、水、測(cè)試液于反應(yīng)皿中，加入福林酚試劑（以下簡(jiǎn)稱R1），靜置T1，加入7.5%碳酸鈉（以下簡(jiǎn)稱R2），靜置T2，測(cè)定吸光度A。

式中：A——測(cè)試液吸光度；A0——空白液吸光度；V0——提取液定容體積（mL）。

1.5 參數(shù)的選擇

1.5 1 濾光片波長(zhǎng)的確定

用移液管移取3.00 mL沒食子酸標(biāo)液儲(chǔ)備液，用水定容至100 mL容量瓶中，此工作液濃度為30μg/mL。取該工作液1.00 mL于25 mL比色管中，加入5.0 mL福林酚試劑，搖勻，靜置反應(yīng)4 min，加入4.0 mL碳酸鈉溶液（濃度7.5%），加水定容至10.0 mL，室溫靜置60 min，用10 mm比色皿在波長(zhǎng)濃長(zhǎng)500～800 nm之間掃描，將得到波長(zhǎng)與吸光值的關(guān)系（圖1）。

圖1 波長(zhǎng)對(duì)30 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光值的影響

由圖1可看出，在500～800 nm范圍內(nèi)對(duì)標(biāo)液顯色后進(jìn)行掃描，隨著波長(zhǎng)的增加，吸光值逐漸升高，在700～770 nm時(shí)，吸光值升高不明顯，形成一個(gè)高位平臺(tái)，當(dāng)波長(zhǎng)大于770 nm后，吸光值隨波長(zhǎng)的增加而逐漸降低。結(jié)合間斷化學(xué)分析儀（CleverChem380，德國(guó)）中提供的波長(zhǎng)濾光片510、520、550、630、660、700 nm的實(shí)際情況，確定700 nm為最佳波長(zhǎng)。

1.5.2 樣品體積的確定

分別移取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50、100、150、200 μL，按1.4.3操作，選擇波長(zhǎng)700 nm，試劑R1（福林酚試劑）450 μL試劑R2（碳酸鈉溶液）350μL，反應(yīng)間隔時(shí)間為加入R1靜置120 s，加入R2靜置600 s，將得到不同體積工作溶液與吸光值關(guān)系（圖2）。

由圖2可看出，加入不同的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液體積，按要求稀釋后顯色，吸光度與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液體積并不完全成比例，150 μL線曲間距大效果好，故選擇150 μL樣液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 樣液稀釋比例對(duì)吸光值影響

1.6 儀器參數(shù)的設(shè)置

濾光片：700 nm；樣液及試劑加入量：樣液150 μL；試劑R1（福林酚試劑）450 μL；試劑R2（碳酸鈉溶液）350 μL；反應(yīng)時(shí)間：試劑R1和樣液混勻T1（120 s）后加試劑R2，再反應(yīng)T2（600 s）后自動(dòng)讀取吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

吸光度（A）與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)應(yīng)數(shù)值見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 間斷化學(xué)分析儀測(cè)定沒食子酸工作曲線

2.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

以正山小種為樣品本底，添加3個(gè)加標(biāo)濃度，分6次按1.6參數(shù)要求測(cè)定，本底茶多酚含量為11.96%，計(jì)算回收率，結(jié)果如表2。從表2可以看出，沒食子酸的回收率在96.4%～104.0%。

表2 加標(biāo)回收（n=6）

2.3 方法精密度

選取有代表性的茶葉樣品，運(yùn)用間斷化學(xué)分析儀測(cè)定茶多酚（n=6），結(jié)果如表3所示， 按最嚴(yán)格要求RSD全部小于1.3%，符合GB/T 27417—2008《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[6]中對(duì)方法精密度的要求，表明方法的精密度良好。

表3 方法精密度（n=6）

2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

采用間斷化學(xué)分析儀與國(guó)標(biāo)方法GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》進(jìn)行橫向方法比對(duì)，以驗(yàn)證其方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果如表4所示，同一樣品兩種方法測(cè)定值相對(duì)誤差0.07%～1.24%，相對(duì)誤差小于國(guó)標(biāo)方法允差要求（≤5%），P＞0.05，兩種方法測(cè)出數(shù)據(jù)無顯著差異，方法結(jié)果具有一致性，證明準(zhǔn)確性良好。

表4 間斷化學(xué)分析儀法與國(guó)標(biāo)方法數(shù)據(jù)比對(duì)（n=3）

3 討論

綜上試驗(yàn)結(jié)果，在以下參數(shù)條件下：波長(zhǎng)700 nm，樣品量150 μL，試劑R1（福林酚試劑）450μL，試劑R2（碳酸鈉溶液）350 μL，試劑R1和樣液混勻間隔120 s， R2反應(yīng)間隔600 s，應(yīng)用間斷化學(xué)分析儀對(duì)典型茶葉樣品進(jìn)行自動(dòng)測(cè)定，在標(biāo)液濃度0～50 mg/L范圍線性良好，R2=0.999，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于1.3%。應(yīng)用化學(xué)間斷化學(xué)分析儀對(duì)8種典型樣品（綠茶、紅茶、白茶、鐵觀音、茉莉花茶、肉桂、磚茶、普洱茶）進(jìn)行檢測(cè)，與國(guó)標(biāo)方法GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》對(duì)比，兩種方法測(cè)定相對(duì)誤差0.35%～1.24%，相對(duì)誤差小于在國(guó)標(biāo)方法允差，兩種方法測(cè)定結(jié)果一致性好，而間斷化學(xué)分析儀法更具有操作簡(jiǎn)單、方便快速、節(jié)省人力的優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了使用間斷化學(xué)分析儀，在設(shè)定的參數(shù)條件下，測(cè)定茶葉中茶多酚含量。得出結(jié)論：在波長(zhǎng)700 nm，樣品量150μL，試劑R1（福林酚試劑）450 μL，試劑R2（碳酸鈉溶液）350 μL，試劑R1和樣液混勻間隔120 s， R2反應(yīng)間隔600 s條件下，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法結(jié)果準(zhǔn)確度、精密度一致。