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    食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)分析

    2021-12-16 01:36:08王曉英
    福建輕紡 2021年12期
    關(guān)鍵詞:增菌諾克單增

    王曉英

    (福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院,福建 福州 350002)

    1 引言

    李斯特氏菌為革蘭氏陽性菌,呈圓尾帶狀,是一種非芽孢兼性厭氧菌[1],有6個(gè)種:?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes,LM)、(綿羊)伊氏李斯特氏菌(L.ivanovii)、斯氏李斯特氏菌(L.seeligeri)、格氏李斯特氏菌(L.grayi)、威氏李斯特氏菌(L.welshimeri)、英諾克李斯特氏菌(L.innocua)[2]。這些菌中,只有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌能引起人畜共患病[3]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌,簡(jiǎn)稱“單增李斯特氏菌”,常見于乳制品、肉類、禽類等食品中,易引起新生兒腦膜炎、孕婦流產(chǎn)、成人敗血癥等疾病,多發(fā)于免疫缺陷患者、妊娠婦女、老人和新生兒[4]。其中孕婦感染比健康成年人高達(dá)20倍,2001年,美國(guó)將其列為法定上報(bào)疾病[5]。國(guó)內(nèi)感染單增李斯特氏菌報(bào)告數(shù)量呈上升趨勢(shì),主要以新生兒和孕婦為主[6]。GB 29921—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》規(guī)定熟肉制品和即食生肉制品中不得檢出單增李斯特氏菌[7],因此,單增李斯特氏菌快速、精準(zhǔn)檢測(cè)顯得尤為重要。

    本文從單增李斯特氏菌國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法和VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)應(yīng)用兩方面對(duì)食品中單增李斯特氏菌檢測(cè)展開分析,找出檢測(cè)關(guān)鍵點(diǎn)并提出單增李斯特氏菌快速、精準(zhǔn)檢測(cè)的對(duì)策建議。

    2 國(guó)標(biāo)檢測(cè)法分析

    2.1 LB1和LB2選擇性增菌

    LB 1和LB2均為選擇性增菌液體培養(yǎng)基,含有萘啶酮酸,廣譜抗菌,尤其對(duì)革蘭氏陰性桿菌的抑制生長(zhǎng)能力明顯。多數(shù)情況下,可疑菌經(jīng)LB1增菌培養(yǎng)后進(jìn)行選擇性分離即可被檢測(cè)到,但LB2增菌必不可少,因?yàn)闃悠分腥绻梢删康投?jìng)爭(zhēng)菌含量高,且可疑菌活力很低,需要通過LB2二次增菌培養(yǎng)以提高單增李斯特氏菌的檢出率。

    2.2 選擇性平板分離

    2.2.1 PALCAM瓊脂培養(yǎng)基

    PALCAM 瓊脂除提供必要營(yíng)養(yǎng)外,七葉苷經(jīng)李斯特氏菌水解后,與Fe2+反應(yīng)形成黑色的6,7-二羥基香豆素;氯化鋰和其他的抗生素能抑制G-和大多數(shù)G+。李斯特氏菌屬均可水解七葉苷(表1),在PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上均為圓形、灰綠色菌落,周圍有棕黑色水解圈。因此,當(dāng)樣品中混雜除單增李斯特氏菌以外的李斯特氏菌屬菌種時(shí),PALCAM瓊脂培養(yǎng)基無法快速篩選出單增李斯特氏菌。

    2.2.2 顯色培養(yǎng)基

    李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基,均含有一些細(xì)菌特異性酶的顯色底物,檢驗(yàn)人員可根據(jù)菌落顏色或是否有乳白色暈環(huán)等對(duì)可疑菌做出快速篩選,可極大提高單增李斯特氏菌的檢出率和準(zhǔn)確性。HKListeria和CHROMagar Listeria對(duì)單增李斯特氏菌基本無抑制作用,可根據(jù)菌落顏色和形態(tài)直接對(duì)單增李斯特氏菌進(jìn)行分離篩選。其具有較高靈敏度、特異性和選擇性,是非常有效的選擇性分離培養(yǎng)基。一般情況下,單增李斯特氏菌在HKListeria呈現(xiàn)藍(lán)綠色菌落,在CHROMagar Listeria有明顯的白色暈環(huán)(圖1)。為避免出現(xiàn)假陽性,檢測(cè)人員可將可疑菌分離純化后輔以木糖、鼠李糖試驗(yàn)初步確證。

    圖1 單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基菌落形態(tài)

    2.3 木糖、鼠李糖試驗(yàn)

    從顯色平板上選取可疑菌進(jìn)行木糖、鼠李糖試驗(yàn),單增李斯特氏菌木糖陰性、鼠李糖陽性,英諾克李斯特氏菌木糖陰性、鼠李糖反應(yīng)不定。因此,通常情況下,除英諾克李斯特氏菌外,其它李斯特氏菌均可與單增李斯特氏菌快速區(qū)分(表1)。選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的生化鑒定。

    表1 單增李斯特氏菌生化特征與其他李斯特氏菌的區(qū)別

    3 VITEK 2 Compact 30鑒定分析

    目前,VITEK 2 Compact 30已成為食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)可疑菌鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”,檢測(cè)人員在可疑菌的鑒定環(huán)節(jié)普遍采用VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)。然而,當(dāng)前測(cè)試卡反應(yīng)底物下,單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌反應(yīng)類型極為相似,僅PIPLC反應(yīng)存在差別(表2)。因此,顯色培養(yǎng)基上的單增李斯特氏菌可疑菌落經(jīng)VITEK 2 Compact 30鑒定后,結(jié)果有可能被誤定為英諾克李斯特氏菌,且可信度達(dá)到可接受水平(≥85%),嚴(yán)重影響了檢測(cè)人員對(duì)可疑菌的準(zhǔn)確檢出。類似情況,國(guó)內(nèi)的多家檢測(cè)機(jī)構(gòu)在參加檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)能力驗(yàn)證中均有遇到。筆者咨詢儀器售后服務(wù)工程師后,認(rèn)為可能是VITEK 2 Compact 30分析軟件版本的影響,也可能是菌株生長(zhǎng)狀態(tài)的差異。

    表2 單增李斯特氏菌VITEK 2 COMPACT反應(yīng)情況

    4 檢測(cè)關(guān)鍵點(diǎn)和對(duì)策建議

    綜上,食品中單增李斯特氏菌檢測(cè)關(guān)鍵在于區(qū)分英諾克李斯特氏菌和單增李斯特氏菌。國(guó)標(biāo)法雖然操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),但仍是目前公認(rèn)的最可靠的方法。為了準(zhǔn)確區(qū)分英諾克李斯特氏菌和單增李斯特氏菌,本文在傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)(圖2)。檢測(cè)人員可用SN/T 5224—2019《出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR內(nèi)標(biāo)法》[8]對(duì)LB2增菌液進(jìn)行快速篩查以初步判斷是否含單增李斯特氏菌。顯色平板上分離所得可疑菌接種木糖和鼠李糖并進(jìn)行溶血試驗(yàn),同時(shí)劃線TSA-YE平板充分純化。一般情況下,單增李斯特氏菌在新鮮血平板上具有清晰、狹窄、明亮的溶血圈。選擇具有明顯溶血的TSA-YE培養(yǎng)純菌落通過VITEK 2 Compact 30全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)和API Listeria測(cè)試卡鑒定。在VITEK 2 Compact 30鑒定結(jié)果與顯色培養(yǎng)基菌落形態(tài)、溶血實(shí)驗(yàn)和熒光PCR檢測(cè)結(jié)果均不一致的情況下,以API Listeria測(cè)試卡補(bǔ)充鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為最終判斷標(biāo)準(zhǔn)。

    圖2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序

    5 討論

    單增李斯特氏菌是一種重要的食源性致病菌,廣泛分布于自然界中,當(dāng)人食用污染有單增李斯特氏菌的食物后,極易發(fā)病,尤其對(duì)新生兒、老年人、孕婦等免疫力低下者。WHO已將單增李斯特氏菌列為四大食源性致病菌之一[9]。國(guó)標(biāo)檢測(cè)法對(duì)樣品進(jìn)行選擇性增菌,然后根據(jù)顯色平板上的特征性菌落分離單增李斯特氏菌,再經(jīng)過一系列生化試驗(yàn)進(jìn)行確證,所需設(shè)備要求、成本低,但操作性強(qiáng),對(duì)檢驗(yàn)人員檢測(cè)法的掌握程度要求高。筆者認(rèn)為,在傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)檢測(cè)法基礎(chǔ)上輔以一些快速檢測(cè)設(shè)備如熒光PCR進(jìn)行初篩是單增李斯特氏菌檢測(cè)的有效手段。另外,國(guó)標(biāo)檢測(cè)法中顯色培養(yǎng)基的應(yīng)用至關(guān)重要,國(guó)產(chǎn)的有HKListeria,進(jìn)口的有CHROMagar Listeria,單增李斯特氏菌菌落特征明顯,可有效分離出可疑菌。單增李斯特氏菌具有獨(dú)特的溶血特征,對(duì)于顯色培養(yǎng)基上的可疑菌落先做溶血實(shí)驗(yàn),綜合溶血、木糖、鼠李糖反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行可疑菌落的后續(xù)鑒定,可大大增強(qiáng)目標(biāo)菌選擇的準(zhǔn)確性。API Listeria測(cè)試卡中的DIM孔是梅里埃的專利,用于檢測(cè)房基酰胺酶,專門用于區(qū)分單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌,可等同或替代VITEK 2 Compact 30的鑒定結(jié)果[10]。再者,表1中所列是李斯特氏菌屬典型菌株的生化反應(yīng)特征,但有些菌株某些反應(yīng)類型具有差異,如少數(shù)單增李斯特菌溶血實(shí)驗(yàn)為陰性(ATCC 15313),少數(shù)英諾克李斯特菌木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性(CICC 10416)等,檢驗(yàn)人員不能單純通過表1或某個(gè)生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確認(rèn)或排除某一種李斯特氏菌,需同時(shí)采用多種方法進(jìn)行綜合判斷。

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