不同檢測方法對妊娠晚期B族鏈球菌的篩查比較

樊春卉 金 嫻▲ 朱平安 譚 萍 張艮芳 黃曉彤 陳 芳

1.深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518081；2.深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東深圳 518081

B族鏈球菌（GBS）是孕婦圍生期感染中比較常見的病原菌，又叫無乳鏈球菌。目前全球范圍內(nèi)GBS的檢出率有所差異，受地區(qū)、種族差異及檢測方法不一影響，檢出率在5%～30%[1-2]。直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法對實(shí)驗(yàn)條件沒有太高的要求，不少醫(yī)院均可以做到，但是檢出率較低，甚至?xí)霈F(xiàn)漏診的情況，對GBS治療造成一定的影響。有報道稱免疫層析法和實(shí)時熒光定量PCR法（以下簡稱“PCR法”）能快速檢測GBS，且有很高的檢測率[3-4]。本研究采用不同檢測方法對選擇性肉湯培養(yǎng)基增菌進(jìn)行前后檢測，并統(tǒng)計(jì)分析各方法的檢測結(jié)果，為臨床不同GBS檢測需求提供合理的檢測方案，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月～2019年7月于深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院接受產(chǎn)檢的702例妊娠晚期孕婦作為研究對象，年齡22～39歲，平均（28.3±3.9）歲；孕齡35.2～37.1周，平均（35.9±0.6）周。納入標(biāo)準(zhǔn)：35周≤孕齡＜38周；孕婦知情同意且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1周內(nèi)使用過抗菌藥或陰道周圍外用清洗劑的孕婦。本研究經(jīng)深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)后開展。

1.2 試劑、儀器和方法

1.2.1 試劑和儀器 選擇性肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物科技有限公司）；血平板（鄭州安圖生物工程有限公司）；細(xì)菌鑒定儀器（法國生物梅里埃公司，型號：VITEK2 COMPACT）；免疫層析試劑盒（北京金沃夫生物工程技術(shù)有限公司，批號20170801）；全自動熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號：ViiA 7Dx）；GBS核酸檢測試劑盒、陰性和陽性對照試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司，批號2018001）。

1.2.2 方法 ①采集標(biāo)本：標(biāo)本為研究對象陰道-直腸分泌物。②增菌培養(yǎng)：將樣品置于選擇性肉湯培養(yǎng)基中增菌，在濃度為5%～10%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，溫度設(shè)置為35℃，本次操作方式實(shí)施無菌操作。③分離培養(yǎng)及鑒定：將增菌前的樣品及增菌液接種于血平板，依舊在濃度為5%～10%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，溫度同樣設(shè)定為35℃。血平板上可疑的GBS菌落呈灰白色，表面光滑凸出，透光。疑似菌落生化鑒定：革蘭染色陽性，觸酶試驗(yàn)陰性，CAMP試驗(yàn)陽性，再上機(jī)鑒定為無乳鏈球菌。分別選擇無乳鏈球菌和化膿性鏈球菌的質(zhì)控菌株作為陽性對照與陰性對照。④免疫層析法檢測：增菌前樣本和1 mL增菌液進(jìn)行檢測，操作方式按照試劑盒要求實(shí)行。⑤PCR法檢測：增菌前樣本加入1 mL生理鹽水振蕩及增菌液1 mL離心后棄上清，再分別加入DNA提取液，100℃裂解10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液5 μL作為模板實(shí)施PCR擴(kuò)增，其結(jié)果判定依據(jù)試劑盒說明書。

1.3 評價標(biāo)準(zhǔn)

金標(biāo)準(zhǔn)以增菌后的細(xì)菌培養(yǎng)法為準(zhǔn)，對不同檢測方式的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確性和一致性實(shí)施分析比較。靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%，特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%，準(zhǔn)確性=（真陽性+真陰性）/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；各組檢查實(shí)施相同性的Kappa檢驗(yàn)，若Kappa＞0.6則存在較好的一致性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法與增菌細(xì)菌培養(yǎng)法檢測結(jié)果的比較

直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法與增菌細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測結(jié)果見表1。增菌后細(xì)菌培養(yǎng)法陽性檢出率為9.4%（66/702），直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法陽性檢出率為2.8%（20/702），兩種檢測方法的陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.210，P=0.000）。直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法的靈敏度為27.3%（18/66），特異度為99.7%（634/636），準(zhǔn)確性為92.9%（652/702），一致性檢測Kappa=0.392。

表1 直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法與增菌細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測結(jié)果（例）

2.2 免疫層析法和增菌細(xì)菌培養(yǎng)法檢測結(jié)果的比較

免疫層析法與增菌細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測結(jié)果見表2。增菌前和增菌后的免疫層析法陽性率分別為4.6%（32/702）、13.8%（97/702），免疫層析法增菌前后的陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=36.066，P=0.000）。增菌前免疫層析法檢測的靈敏度為36.4%（24/66），特異度為98.7%（628/636），準(zhǔn)確性為92.9%（652/702），一致性檢測Kappa=0.456。增菌后免疫層析法檢測的靈敏度為80.3%（53/66），特異度為93.1%（592/636），準(zhǔn)確性為91.9%（645/702），一致性檢測Kappa=0.606。免疫層析法增菌前后的靈敏度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.213，P=0.000）；免疫層析法增菌前后的特異度、準(zhǔn)確性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 免疫層析法與增菌細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測結(jié)果（例）

2.3 PCR法與增菌細(xì)菌培養(yǎng)法檢測結(jié)果的比較

PCR法與增菌細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測結(jié)果見表3。增菌前和增菌后PCR法陽性率分別為8.5%（60/702）、12.5%（88/702），PCR法增菌前后的陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.922，P=0.015）。增菌前PCR法檢測的靈敏度為65.2%（43/66），特異度為97.3%（619/636），準(zhǔn)確性為94.3%（662/702），一致性檢測Kappa=0.651。增菌后的靈敏度為87.9%（58/66），特異度為95.3%（606/636），準(zhǔn)確性為94.6%（664/702），一致性檢測Kappa=0.724。PCR法增菌前后的靈敏度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.486，P=0.002）；PCR法增菌前后的特異度、準(zhǔn)確性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 PCR法與增菌細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測結(jié)果（例）

3 討論

我國于2010年出臺對GBS篩查指南，直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法在各大醫(yī)院得到廣泛應(yīng)用。但有文獻(xiàn)指出[5-6]，直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法的陽性檢出率很低，導(dǎo)致有漏診情況的發(fā)生。近年來，國內(nèi)醫(yī)院開始采用選擇性肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，許多研究表明，增菌后的細(xì)菌培養(yǎng)有很高的陽性檢出率[7-9]。此外有研究表明[10-11]，免疫層析法或PCR法在臨床中利于陽性檢出率的提高，對于臨床GBS篩查更適用。

本研究結(jié)合文獻(xiàn)對不同篩選方式進(jìn)行探討，結(jié)果顯示，增菌后細(xì)菌培養(yǎng)法陽性檢出率高于直接接種細(xì)菌培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與相關(guān)文獻(xiàn)報道[12]相似，提示采用選擇性肉湯培養(yǎng)基可提高陽性檢出率。其主要原因是選擇性肉湯培養(yǎng)基中含有萘啶酸、黏菌素等抗菌藥物，能很好地抑制受試者陰道-直腸標(biāo)本中非目標(biāo)細(xì)菌的生長。此外，用免疫層析法和PCR法對增菌前后的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，免疫層析法增菌前陽性率為4.6%，與顧向明等[13]研究結(jié)果（5.74%）相當(dāng)；但增菌后免疫層析法陽性率為13.8%，顯著高于增菌前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。增菌前PCR法陽性率為8.5%，增菌后PCR法陽性率為12.5%，增菌后顯著高于增菌前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以增菌后細(xì)菌培養(yǎng)法檢測為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，免疫層析法和PCR法在增菌后的檢測靈敏度高于增菌前檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；免疫層析法與PCR法增菌后的特異度與準(zhǔn)確性與其增菌前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在一致性評價中，免疫層析法增菌前的Kappa值低于0.6，增菌后Kappa值高于0.6，提示增菌后免疫層析法的臨床可靠性更高。而增菌前后PCR法的Kappa值均高于0.6，且均高于免疫層析法，提示PCR法的可靠性略優(yōu)于免疫層析法?？紤]該兩種方法對于細(xì)菌培養(yǎng)法中GBS生長發(fā)育的狀況可以不予考慮，而且可以檢測出非β型溶血性GBS及CAMP陰性的B族鏈球菌，因此其陽性檢出率會更高。免疫層析法檢測比較方便易上手，專業(yè)技術(shù)要求低，檢測時間較短，靈敏度相對不高，但經(jīng)過選擇性肉湯培養(yǎng)基增菌后可彌補(bǔ)其靈敏度較低的不足，適合基層醫(yī)院臨床初步檢測[14]。而PCR法相對有些復(fù)雜，但其靈敏度更高，一致性更好，不過要采用全自動熒光定量PCR儀，完成批量檢測的檢驗(yàn)時間需要3 h，對于基層地區(qū)醫(yī)院來說，檢測要求較高，醫(yī)療條件較好的醫(yī)院推薦使用PCR法[15-16]。

綜上所述，選擇性肉湯培養(yǎng)基增菌后陽性檢出率更高，細(xì)菌培養(yǎng)法檢測準(zhǔn)確但是耗時較長且對工作人員專業(yè)水平要求較高。增菌后的免疫層析法檢測方便快捷彌補(bǔ)了靈敏度相對較低容易出現(xiàn)假陰性的缺點(diǎn)，可作為基層醫(yī)院妊娠晚期GBS初步篩查方式。PCR法則具備靈敏度較高、一致性好且檢測耗時短、可批量操作的優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)先推薦具備PCR檢測手段的醫(yī)院使用PCR法檢測。