屎腸球菌R40產膽鹽水解酶發(fā)酵動力學及底物特異性分析

雷霜江，呂青遙，王文杰，楊 浩，孫博瑞，武雪梅，焦士蓉

（西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610039）

膽固醇（cholesterol，CHOL）是一種27碳環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，是構成細胞的關鍵成分且能轉化為類固醇激素，并且作為合成維生素D3的原料及膽汁酸的前體物質，在人體中發(fā)揮著重要的作用[1]。隨著經濟發(fā)展，人民生活質量的提高，日常的飲食習慣向高熱量高脂肪轉化，不良的飲食習慣導致膽固醇攝入量急劇上升，從而引發(fā)膽結石、糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化等慢性疾病[2-5]。膳食指南推薦，每人每日推薦攝入膽固醇200 mg。膽固醇攝入量過高，嚴重危害到人體健康，采取一定方法干預人體內膽固醇的代謝，從而維持體內的膽固醇平衡對身體健康至關重要[6-7]。

膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）是微生物生長過程中產生的一種蛋白質代謝產物，具有較強的降解膽固醇的能力[8]。乳酸菌是產生BSH的主要菌株，如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[9-11]、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）[12]和腸球菌屬（Enterococcussp.）[13]。在人體中，膽鹽約占膽汁有機成分的50%，結合膽鹽根據氨基酸基團的不同和膽酸基團的羥基位置和數量不同主要分為[14]：9%?；悄扄}（taurocholate，TCA）、9%?；敲撗跄扄}（taurodeoxycholate，TDCA）、8%牛磺鵝脫氧膽鹽（taurochenodesoxycholate，TCDCA）、26%甘氨膽鹽（glycocholate，GCA）、22%甘氨脫氧膽鹽（glycodeoxycholate，GDCA）、26%甘氨鵝脫氧膽鹽（glycochenodesoxycholate，GCDCA）。研究表明，微生物產生的膽鹽水解酶存在一定的底物特異性[15]，不同種屬的微生物在發(fā)酵過程中產生的膽鹽水解酶的種類不同且特異性不同。

發(fā)酵動力學是描述微生物生長活動中菌體生長、底物消耗及產物形成之間內在關系規(guī)律的方法[16]。微生物的整個發(fā)酵過程可以分為延滯期、對數期、穩(wěn)定期及死亡期，曲線呈典型S型。本實驗使用Logistic模型進行描述菌體生長動力學；使用Leudeking-priet通用模型進行描述和計算產物生成動力學模型時，因產物的形成與菌體生長的關系不同，在計算模型參數時代入值有所差異[17]。底物消耗可根據底物消耗途徑不同，及是否直接影響產物生成，選擇不同的方程進行模擬，本實驗選擇Luedeking方程描述底物消耗過程。

本研究通過建立發(fā)酵動力學模型，觀察在模擬人體膽鹽條件下，屎腸球菌（Enterococcus faecium）R40的菌體生長與葡萄糖消耗及膽鹽水解酶產生的內在關系，對其能否以活菌的形式在人體內發(fā)揮降膽固醇作用提供數據基礎和參考，并根據不同膽鹽設置不同培養(yǎng)基條件，通過降膽固醇過程的跟蹤及分析，判斷不同膽鹽與屎腸球菌R40的生長、降膽固醇能力間的相互關系，觀察屎腸球菌R40產生的膽鹽水解酶是否具有一定的底物特異性，為更加高效利用屎腸球菌R40提供基礎研究支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

屎腸球菌（Enterococcus faecium）R40：分離自發(fā)酵食品，保存于本實驗室。

1.1.2 試劑

?；悄扄}、?；敲撗跄扄}、?；蛆Z脫氧膽鹽、甘氨膽鹽、甘氨脫氧膽鹽、甘氨鵝脫氧膽鹽（均為生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；?；撬針藴势?、甘氨酸標準品（均為色譜純）：江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司；三乙胺、乙腈（均為色譜純）：羅恩試劑有限公司；茚三酮（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；牛血清蛋白（純度＞99%）：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉10.0 g，酵母浸粉5.0 g，檸檬酸氫二胺2.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫80 1.0 mL，蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

MRS+膽固醇培養(yǎng)基：300 mL MRS液體培養(yǎng)基中加入1份膽固醇溶液（稱取膽固醇0.12 g，加入0.6 mL吐溫80、5 mL冰乙酸，振蕩后超聲，50 ℃條件下溶解，然后用0.4 μm過濾膜除菌），采用12 mL 6 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至6.5左右，振蕩搖勻后即得。

模擬人體膽鹽培養(yǎng)基：根據人體中膽鹽比例，在MRS+膽固醇培養(yǎng)基中加入總膽鹽濃度為0.3%的結合膽鹽。

1.2 儀器與設備

Acquity UPLC H-Class型超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀（配帶紫外檢測器）：美國Waters公司；Hypersil ODS（C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：島津技彌（上海）商貿有限公司；Scientz-IID超聲細胞破碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；I3X酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；Centrifuge 5804R冷凍離心機：德國Eppendorf公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 屎腸球菌R40分批發(fā)酵動力學模型的建立及參數求解

將保存的屎腸球菌R40接種于MRS液體培養(yǎng)基中活化，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h即得發(fā)酵種子液。將種子液按2%（V/V）的接種量接種于各個批次的模擬人體膽鹽培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)26 h，每隔2 h取出對應批次的樣品，測定發(fā)酵液的菌體生物量、葡萄糖含量、膽鹽水解酶活力，選擇合適方程建立動力學模型并求解參數。

1.3.2 膽鹽水解酶的底物特異性分析

以接菌后的MRS培養(yǎng)基、MRS+膽固醇培養(yǎng)基為對照，在MRS+膽固醇培養(yǎng)基中分別添加0.3%的TCA、TDCA、TCDCA、GCA、GDCA、GCDCA、模擬人體膽鹽，并分別設定 為TCA 組、TDCA 組、TCDCA 組、GCA 組、GDCA 組、GCDCA組、模擬人體膽鹽組，其中模擬人體膽鹽組各種膽鹽比例依照人體膽鹽比例計算后添加。將活化好的菌株以1%（V/V）的接種量分別接種于以上培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 h取樣，測定其生物量的變化情況，每組試驗做3組平行并求均值。

1.3.3 分析檢測

菌體生物量的測定[15]：取10 mL發(fā)酵液于離心管中，4 ℃、6 000 r/min離心20 min，取沉淀，用無菌生理鹽水洗滌沉淀兩次，經80～90 ℃烘干至質量恒定后稱質量。

葡萄糖消耗量的測定：采用斐林試劑法[17]。

膽鹽水解酶活力的測定：參考畢潔等[18-19]的方法。膽鹽水解酶活力定義：每分鐘底物釋放1 μmol牛磺酸或甘氨酸的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

2 結果與分析

2.1 屎腸球菌R40分批發(fā)酵動力學模型的建立及動力學參數求解

屎腸球菌R40在模擬人體膽鹽中的生長情況見圖1。

圖1 屎腸球菌R40的發(fā)酵動力學曲線Fig.1 Fermentation kinetic curve of Enterococcus faecium R40

2.1.1 菌體生長動力學模型的建立及參數求解

屎腸球菌R40細胞的生長變化可分為4個階段：0～4 h為延滯期，4～10 h為對數生長期，10 h后進入穩(wěn)定期。生長曲線為典型的S型曲線，故選擇Logistic方程描述屎腸球菌R40在模擬人體膽鹽條件下的生長規(guī)律。

對數生長期菌體細胞的增長速率表達式為：

式中：X為生物量，g/L；Xm為菌體能達到的最大生物量，g/L；t為時間，h；μm為最大比生長速率，h-1。

穩(wěn)定期菌體生物量不再增加，故X=Xm=4.652 g/L，初始條件t=0，將其代入公式（1），整理后得公式（2），即屎腸球菌R40在對數生長期和穩(wěn)定期的生長狀態(tài)表達式為：

2.1.2 產物生成動力學模型的建立及參數求解

產物生成動力學模型通常采用Luedeking-Piret通用方程進行描述?；颈磉_式為公式（3）：

式中：P為膽鹽水解酶活性，U；t為時間，h；α為與菌體生長相關的合成酶常數；β為與菌體量相關的合成酶常數；X為菌體生物量，g/L。

由圖1可知，膽鹽水解酶的合成與菌體的生長關系為生長部分耦聯型，即α、β均≠0。當菌體生長處于穩(wěn)定期，則：

以t=0，P=0為初始條件，公式（1）積分變形后得：

將公式（4）代入公式（5）中，積分后得：

則公式（6）可寫為：

由菌體生長穩(wěn)定期的膽鹽水解酶濃度P對發(fā)酵時間t作圖，得到一條直線方程為y=0.152x+113.42，相關系數R2=0.913 85，故=0.032 7，將參數μm、X0、Xm、β代入公式（6），求得α=49.116；將確定值代入公式（6），得菌體產物生成動力學模型方程為：

2.1.3 底物消耗動力學模型的建立及參數求解

微生物發(fā)酵過程中，常通過三種途徑消耗底物：細胞生長、維持細胞的生命活動、產生代謝產物時所利用。由圖1可知，屎腸球菌R40并非直接利用葡萄糖產生膽鹽水解酶，故可忽略底物消耗用于產生膽鹽水解酶這一途徑，采用Luedeking方程建立底物消耗動力學模型，其方程為：

式中：S為葡萄糖含量，g/L；t為時間，h；X為菌體生長量，g/L。

穩(wěn)定期，X=Xm，代入公式（8）可得：

將公式（4）代入公式（9）并積分后，即可求得：

則公式（10）可簡寫為：

葡萄糖濃度與時間存在線性相關，求得方程為S=-0.071 6t+15.049，相關系數R2=0.911 0，求得=-0.071 6，θ=0.153 9，將求得參數代入公式（11）中，可求得ε=5.712 2，將上述所有參數代入公式（10），即可求得葡萄糖消耗動力學模型方程式為：

2.1.4 模型驗證

為確定實驗擬合模型的可靠性，對模型的預測值和試驗值進行比對，結果見表1。由表1可知，模型預測值與試驗結果值誤差均小于10%，說明模型的預測值與試驗結果擬合較好。

表1 屎腸球菌R40發(fā)酵動力學模型預測值與試驗值比較結果Table 1 Comparison results of predicted and experimental values of Enterococcus faecium R40 fermentation kinetic model

2.2 不同膽鹽對屎腸球菌R40生長的影響

屎腸球菌R40在不同膽鹽條件下的生長情況見圖2。

圖2 屎腸球菌R40在不同膽鹽條件下的生長曲線Fig.2 Growth curves of Enterococcus faecium R40 under different bile salt conditions

由圖2可知，發(fā)酵種子液轉入到實驗組培養(yǎng)基中后，適應期極短，除GDCA、MRS+膽固醇、MRS組外，其他組屎腸球菌R40在發(fā)酵4 h后即可進入對數生長期，發(fā)酵8 h后進入穩(wěn)定期，所有組別中的最大菌體生物量為4.764 g/L，發(fā)酵后期菌體開始自溶死亡，菌體生物量有緩慢下降的趨勢。在膽鹽和膽固醇同時存在的情況下，屎腸球菌R40的生長情況較好，說明在只有膽固醇存在的情況下，屎腸球菌R40不表現明顯的膽固醇降解能力，且生長受到膽固醇分子的脅迫，生長能力相對較差，故推斷膽鹽的存在是乳酸菌降解膽固醇的必要條件[20]。李堯[21]研究了不同濃度的膽鹽對乳酸菌降膽固醇能力的影響，結果表明，膽鹽含量在0.3%～0.4%的條件下屎腸球菌R40對膽固醇降解能力相對較強。本實驗證明，膽鹽的存在一定程度上能夠提高屎腸球菌R40對膽固醇的耐受能力。計算得屎腸球菌R40在不同膽鹽中的代時，結果見表2。由表2可知，屎腸球菌R40在含有GCA和GDCA的條件下代時較短，說明其對GCA與GDCA的適應能力最好。

表2 屎腸球菌R40在不同膽鹽條件下的代時Table 2 Generation of Enterococcus faecium R40 under different bile salt conditions

以MRS培養(yǎng)基和MRS+膽固醇培養(yǎng)基為對照，比較7種不同膽鹽對屎腸球菌R40生長情況的影響，對9組實驗組的最大生物量數據進行多重T檢驗-差異性分析，P值見表3。

表3 不同膽鹽對屎腸球菌R40生長能力影響的差異性分析Table 3 Difference analysis of effect of different bile salts on the growth ability of Enterococcus faecium R40

結合圖2及表3可知，屎腸球菌R40對膽鹽的識別具有一定差異性，其中GDCA對屎腸球菌R40的生長促進作用相對薄弱，GDCA的加入并未縮短菌株生長適應期，但在對數期生長更加穩(wěn)健，最終的菌體生物量與MRS組相比有較大差距。GCA和TCA相對于MRS組，提前4 h進入對數期，其對屎腸球菌R40的生長的促進作用主要表現在對適應期的縮短，且最終的菌體生物量與MRS組接近。TDCA、TCDCA、GCDCA以及模擬人體膽鹽組與MRS組相比，對屎腸球菌R40的生長均表現在縮短適應期和提高生長量兩個方面，且4組組間不存在顯著性差異（P＞0.05）。

3 結論

屎腸球菌R40在37 ℃、模擬人體膽鹽培養(yǎng)基下的菌體生長、膽鹽水解酶生成及葡萄糖消耗的動力學模型相關系數均＞0.9，擬合情況良好。將模型預測值與試驗測量值進行對比驗證，所得誤差均＜10%。表明可以通過建立發(fā)酵動力學模型對屎腸球菌R40產酶情況進行預測和描述。膽鹽的添加有利于屎腸球菌R40發(fā)揮降膽固醇作用，使菌株提前4 h進入對數生長期，且提高了菌株R40的生物量。不同膽鹽對菌株R40的影響存在差異性，甘氨酸脫氧膽鹽雖能提高生物量，但未縮短適應期。牛磺酸膽鹽和甘氨酸膽鹽縮短了菌株R40的適應期，但對生物量并無顯著影響，說明菌株R40產的膽鹽水解酶具有一定的底物特異性。