響應(yīng)面法優(yōu)化玫瑰紅豆復(fù)合米酒發(fā)酵工藝

彭春芳，袁松林，劉琨毅，陸 兵，李秀萍，陳 卓

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644003；2.宜賓市金喜來酒業(yè)有限公司，四川 宜賓 644104）

玫瑰（Rosa rugosa）為薔藻科灌木植物，花色艷麗，花香芬芳濃郁，花瓣中含有花青素、多酚、抗氧化劑、維生素等多種營養(yǎng)元素[1]。玫瑰花具有抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、行氣活血、改善脾胃、解郁安神等功效[2-4]。經(jīng)常食用含玫瑰花的食品可以增強(qiáng)體質(zhì)、改善膚質(zhì)，因此深受廣大女性青睞。

赤小豆（Vigna umbellata）是豆科一年生草本植物[5]，其成熟的種子顏色暗紅，民間俗稱為紅豆。其富含黃酮、酚類化合物、蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶等多種活性成分[6-8]。紅豆是藥食同源食物，具有清熱解毒、行血補(bǔ)血、利水消腫、健脾去濕等功效[5，8]，常用于制作各種食品。

米酒又稱甜酒釀，是我國傳統(tǒng)發(fā)酵型飲品，以糯米為主要原料，蒸煮糊化后加入酒曲經(jīng)特殊發(fā)酵工藝釀制而成[8]。米酒酸甜可口、醇香誘人，酒精度低，可以直接飲用，也可用于制作各種小吃美食，深受消費(fèi)者歡迎。此外米酒還具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能[9]。在民間，甜米酒早已成為開胃健脾、產(chǎn)婦催奶的絕好佳品。

目前，米酒產(chǎn)品開發(fā)主要集中在添加某一種谷物、花卉、水果或保健食材，而用多種食材加工復(fù)合米酒的研究比較少[10-11]。玫瑰和紅豆的組合在食品加工中運(yùn)用廣泛，但將二者結(jié)合在米酒制作中尚缺乏研究。該試驗(yàn)以食用玫瑰、紅豆及糯米為原料，采用單因素試驗(yàn)考察不同因素對(duì)玫瑰紅豆復(fù)合米酒品質(zhì)的影響，再利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵工藝，研制出一款清新雅致，獨(dú)具特色的復(fù)合米酒，為復(fù)合米酒開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用玫瑰（干花）、紅豆（赤小豆）、糯米：市售；安琪甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉、硫酸銅、次甲基藍(lán)指示劑、苯酚、氯化鉀（均為分析純）：成都市金山化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、硫酸（均為分析純）：天津市化工三廠有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004型電子分析天平：上海上平精密儀器有限公司；LDZX-30KBS型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司；BJPX-400型恒溫培養(yǎng)箱：卓絕醫(yī)療器械有限公司；JS39D-250型榨汁機(jī)：浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司；C21-RT2120型電磁爐：美的生活電器有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋：上海力辰西儀器有限公司；PHSJ-4A型pH計(jì)：上海雷磁儀器有限公司；LMN5D-5L發(fā)酵罐：駱易家玻璃制品廠；1 000 mL真空抽濾裝置：上海暉創(chuàng)化學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰紅豆復(fù)合米酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

糯米和紅豆的浸泡：選取優(yōu)質(zhì)糯米，置于無油污容器中，清洗2～3次，料水比1∶2（g∶mL），室溫浸泡12 h。浸泡后的糯米用手指一捻即碎，若米粒不捻已碎則說明浸泡時(shí)間過長，相反若有白心則說明浸泡時(shí)間不夠[12]。選取色澤暗紅且有光澤的優(yōu)質(zhì)紅豆，洗凈后按料水比1∶2（g∶mL）室溫浸泡14～16 h[13-14]。

玫瑰花的處理[15]：選擇當(dāng)年產(chǎn)制的顏色鮮亮、香氣芬芳濃郁的干花蕾，冷水沖洗后用200 mL沸水沖泡，保溫30 min，打漿備用。

蒸飯：將浸泡后的糯米和紅豆混合均勻，用蒸鍋常壓蒸米30 min，要求米粒膨脹糊化，內(nèi)無白心，松散柔軟，但不粘黏成團(tuán)[12]。

淋冷：將蒸煮好的糯米和紅豆用1 L無菌蒸餾水淋冷至30 ℃左右。

混合、拌曲、搭窩：按照料液比1∶1（g∶mL）加入無菌蒸餾水，加入玫瑰花漿、甜酒曲，充分混勻，裝入5 L發(fā)酵罐，中間挖一個(gè)倒喇叭形圓窩，用保鮮膜封口[12]。

發(fā)酵：將發(fā)酵罐置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵，直至中間圓窩中流出酒液并漸漸沒過原料。

過濾、滅菌：醪液用雙層無菌尼龍布過濾，分裝至180mL無菌玻璃瓶，巴氏滅菌（65 ℃、30 min）[15]，冷卻后即為玫瑰紅豆復(fù)合米酒成品。

1.3.2 玫瑰紅豆復(fù)合米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

按照1.3.1的操作流程和要點(diǎn)，以還原糖含量、總酸含量、酒精度及感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在糯米質(zhì)量為2 kg、玫瑰花添加量為糯米質(zhì)量的1.0%、紅豆添加量為5.0%、酒曲添加量0.3%及30 ℃發(fā)酵48 h的基礎(chǔ)條件下，每次只改變4個(gè)因素中的1個(gè)因素，保持其他因素不變，分別考察酒曲添加量（0.1%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%）、發(fā)酵時(shí)間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）、玫瑰花添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、紅豆添加量（5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、30.0%）對(duì)復(fù)合米酒品質(zhì)的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)各因素和水平[15-17]。以酒曲添加量（A），發(fā)酵時(shí)間（B），玫瑰花添加量（C）及紅豆添加量（D）為影響因素，玫瑰紅豆復(fù)合米酒感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 分析檢測(cè)

酒精度測(cè)定：按照國標(biāo)GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》[18]；還原糖測(cè)定：按照國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]；總酸測(cè)定：按照國標(biāo)GB 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[20]；大腸桿菌數(shù)測(cè)定：按照國標(biāo)GB/T 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[21]；菌落總數(shù)測(cè)定：按照國標(biāo)GB/T 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[22]。

感官評(píng)價(jià)：由10名三級(jí)品酒師組成的評(píng)定小組從外觀、香氣、滋味、風(fēng)格等4個(gè)方面進(jìn)行感官綜合評(píng)定，滿分100分。參考農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1885—2010《綠色食品米酒》[23]建立玫瑰紅豆復(fù)合米酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 玫瑰紅豆復(fù)合米酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of rose and red bean compound rice wine

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰紅豆復(fù)合米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 酒曲添加量對(duì)玫瑰紅豆復(fù)合米酒品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著酒曲添加量的增多，酒液還原糖先上升，在酒曲添加量為0.6%后趨于平緩，說明酒曲添加0.6%就足以使淀粉轉(zhuǎn)化完全。酒曲添加量＞0.6%之后，酒精度和總酸升高，說明酒曲中的根霉菌將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，給酵母菌提供了能量來源，大量的根霉消耗環(huán)境中的氧氣，為酵母菌的生長提供了條件[4，24]。感官評(píng)定結(jié)果顯示，隨著酒曲添加量增多，感官評(píng)分先升高后降低，可能是由于隨著酒曲量增大，發(fā)酵速度加快，乙醇、有機(jī)酸等風(fēng)味物質(zhì)增多，酒體風(fēng)味飽滿；但酒曲量過多時(shí)，酒體酸甜比例失調(diào)，苦味突出[11，25]。酒曲添加量為0.6%時(shí)，米酒醇香濃郁，酸甜比例恰當(dāng)，感官評(píng)分最高，為83.5分。因此，選擇最適酒曲添加量為0.6%。

圖1 酒曲添加量對(duì)玫瑰紅豆復(fù)合米酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of Jiuqu addition on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)玫瑰紅豆復(fù)合米酒品質(zhì)的影響

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24～48 h，酒曲中的根霉菌產(chǎn)生大量的淀粉酶和糖化酶，將糊化后的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖[25-28]；還原糖含量持續(xù)升高，酵母菌快速繁殖，酒精度和總酸含量隨之增多[27-29]，感官評(píng)分升高。發(fā)酵時(shí)間＞48 h之后，還原糖含量下降，酵母菌等有益微生物利用還原糖產(chǎn)生乙醇、有機(jī)酸等酒體風(fēng)味物質(zhì)；在發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)，酒體酒精度達(dá)到3.45% vol，感官評(píng)分最高，為88.9分。在發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，酒精度持續(xù)升高，酒味刺鼻，玫瑰花和紅豆的風(fēng)味被掩蓋，且酸度增高，酸甜失調(diào)。因此，選擇最適發(fā)酵時(shí)間為60 h。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)玫瑰紅豆復(fù)合米酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.1.3 玫瑰花添加量對(duì)玫瑰紅豆復(fù)合米酒品質(zhì)的影響由圖3可知，隨著玫瑰花添加量的增多，米酒的還原糖含量、總酸含量和酒精度并未發(fā)生明顯變化。而感官評(píng)分結(jié)果顯示，隨著玫瑰花添加量的增多，復(fù)合米酒感官評(píng)分先升高后降低，在玫瑰花添加量為2.0%時(shí)，感官評(píng)分最高，為82.3分。原因可能是：玫瑰花過少時(shí)，米酒中花香不明顯，顏色偏淡；玫瑰花過多時(shí)，米酒花香太重，掩蓋了米酒的酒香和紅豆的甜香，口感略帶苦澀。因此，選擇最適玫瑰花添加量為2.0%。

圖3 玫瑰花添加量對(duì)玫瑰紅豆復(fù)合米酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of rose flower addition on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.1.4 紅豆添加量對(duì)玫瑰紅豆復(fù)合米酒品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著紅豆添加量增多，還原糖整體小幅度升高，總酸含量和酒精度變化不明顯。這可能是因?yàn)樘砑蛹t豆時(shí)帶入了淀粉，但短時(shí)間內(nèi)這些淀粉對(duì)酒體酒精度影響不大。感官評(píng)定結(jié)果顯示，隨著紅豆添加量增多，復(fù)合米酒感官綜合評(píng)分先升高后降低，在紅豆添加量為15.0%時(shí)，感官評(píng)分最高，為82.3分。因此，選擇紅豆最適添加量為15.0%。

圖4 紅豆添加量對(duì)玫瑰紅豆米酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of red bean addition on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.2 玫瑰紅豆復(fù)合米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)以酒曲添加量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、玫瑰花添加量（C）及紅豆添加量（D）為影響因素，感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化玫瑰紅豆復(fù)合米酒發(fā)酵工藝。Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 Results of Box-Behnken experiments design

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

借助Design Expert 8.0.6軟件，對(duì)試驗(yàn)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型方差分析，結(jié)果見表4。以玫瑰紅豆米酒感官分析為響應(yīng)值，得到多元二次回歸方程如下：

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，該優(yōu)化擬合回歸模型P值＜0.000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)P值=0.067 1＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合程度較好，可以通過該模型確定玫瑰紅豆復(fù)合米酒的最佳發(fā)酵工藝。模型的決定系數(shù)R2=0.939 3，校正決定系數(shù)R2adj=0.878 7，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=7.45%，說明該模型能解釋87.87%響應(yīng)值的變化。分析各因素P值可知，一次項(xiàng)A、C、D、二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)玫瑰紅豆復(fù)合米酒的感官評(píng)分影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)AB、BC、BD、CD對(duì)玫瑰米酒感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05）。分析F值可知，影響玫瑰紅豆復(fù)合米酒感官評(píng)分的因素順序?yàn)椋篈酒曲添加量＞D紅豆添加量＞C玫瑰花添加量＞B發(fā)酵時(shí)間。

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析各因素交互影響

響應(yīng)曲面和等高線是各因素對(duì)響應(yīng)值影響的直觀反映[29]，從響應(yīng)曲面的坡度可以看出其影響的顯著性，從等高線的形狀可以看出兩因素的交互關(guān)系[30]。各因素間的交互作用對(duì)玫瑰紅豆米酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)玫瑰紅豆米酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory score of rose and red bean compound rice wine

由圖5可知，酒曲添加量和發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間和玫瑰花添加量、發(fā)酵時(shí)間和紅豆添加量、玫瑰花添加量和紅豆添加量之間交互作用對(duì)玫瑰紅豆米酒的感官評(píng)分有顯著影響（P＜0.05），這與表4的方差分析結(jié)果一致。

2.3 玫瑰紅豆復(fù)合米酒工藝優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面試驗(yàn)最大值預(yù)測(cè)，得出玫瑰紅豆復(fù)合米酒最佳發(fā)酵工藝條件為：酒曲添加量0.50%，發(fā)酵時(shí)間60.34 h，玫瑰花添加量1.76%，紅豆添加量14.07%。此發(fā)酵工藝條件下模型預(yù)測(cè)玫瑰紅豆復(fù)合米酒感官評(píng)分理論值為94.77分。根據(jù)模型預(yù)測(cè)結(jié)果，結(jié)合實(shí)際操作的可行性，最佳發(fā)酵條件修正為：酒曲添加量為0.5%，發(fā)酵時(shí)間為60 h，玫瑰花添加量為1.8%，紅豆添加量為14.0%。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，玫瑰紅豆復(fù)合米酒感官評(píng)分實(shí)際值為94.10分，與理論值94.77分基本接近，因此該模型預(yù)測(cè)結(jié)果比較可靠。

2.4 玫瑰紅豆復(fù)合米酒的指標(biāo)測(cè)定

經(jīng)檢測(cè)，最佳發(fā)酵工藝條件下生產(chǎn)的玫瑰紅豆米酒的酒精度為3.27% vol，還原糖含量為31.54 g/100 mL，總酸含量為7.95g/L，菌落總數(shù)＜50CFU/mL；大腸桿菌＜3MPN/100g。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以富含花青素的玫瑰花和有行氣補(bǔ)血功效的紅豆以及糯米為原料，研制了一款香味協(xié)調(diào)的復(fù)合米酒?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝，得到玫瑰紅豆復(fù)合米酒的最佳發(fā)酵工藝：糯米中添加14.0%的紅豆，常壓蒸煮糊化，再添加1.8%玫瑰花和0.5%甜酒曲，拌和均勻，30 ℃恒溫發(fā)酵60 h。在此條件下得到的復(fù)合米酒均勻無沉淀，香氣芬芳雅致，口感清甜爽口，風(fēng)格獨(dú)特，感官評(píng)分為94.1分。此產(chǎn)品為傳統(tǒng)米酒增添了新口感，為新型米酒的開發(fā)提供了參考。