響應(yīng)面法優(yōu)化桂花酒釀造工藝

張陽陽，侯賀麗，王榮榮，李建芳，郝晨暉

（信陽農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院，河南 信陽 464000）

桂花是信陽市的市花，含有多種重要的生物活性物質(zhì)，其中黃酮類、多酚類等活性物質(zhì)含量很高，且對人體內(nèi)各種自由基有一定抑制作用[1-4]。桂花酒歷史悠久，古人認(rèn)為桂為百藥之長，用桂花來釀酒可以達(dá)到“飲之壽千歲”的功效，該酒香甜醇厚，有開胃醒神、健脾補(bǔ)虛的功效[5-7]。桂花酒對女士特別適用，被贊譽(yù)為“婦女幸福酒”[8]。目前對于桂花酒的研究主要集中在浸提制取工藝、香氣成分分析與抗氧化研究等方面，如黃夢明等[9]對新型桂花酒的浸提工藝進(jìn)行研究及抗氧化評價(jià)，結(jié)果表明浸提工藝生產(chǎn)的新型桂花酒，總黃酮提取率可達(dá)到91.34%，并具有較強(qiáng)的抗氧化能力；楊淇等[10]研究了桂花酒的制備與其香氣成分分析，結(jié)果表明以浸泡法制備的桂花酒，香氣成分檢測出24種可揮發(fā)性成分，香氣濃郁，但在發(fā)酵桂花酒方面研究較少。

因此本試驗(yàn)以信陽本地的大米和桂花為原料，以黃酒發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)制作桂花酒并對其工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬開發(fā)一種新型發(fā)酵型桂花酒。首先利用植物乳桿菌（Lactobacil-lus plantarum）對大米進(jìn)行酸化，其次以安琪酵母和麥曲共同發(fā)酵消除生物胺對酒口感和飲后舒適度的不良影響，以期提高酯類物質(zhì)使酒更加綿柔，提高其營養(yǎng)價(jià)值[11-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：信陽香絲苗米；桂花：信陽農(nóng)林學(xué)院校園桂花自采自曬；安琪耐高糖高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌凍干粉（食品級）：鄭州百益生物技術(shù)有限公司；麥曲：老河口市任家米酒黃酒加工廠；無水乙醇（體積分?jǐn)?shù)98%）：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；冰乙酸（分析純）：天津市巴斯夫化工有限公司；亞鐵氰化鉀（分析純）：鄭州派尼化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZM-80L-Ⅲ立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；ZHJH-C1112C超凈工作臺：上海分析儀器制造有限公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；SPX-150-BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桂花酒發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

大米預(yù)處理：選取優(yōu)良大米，清洗后置于容器中，加入植物乳桿菌于培養(yǎng)箱中進(jìn)行生酸，在漿水pH降至4.2左右，即可停止發(fā)酵[14-17]。

植物乳桿菌按0.1%（以干米500 g為基準(zhǔn)）添加，在18 ℃培養(yǎng)至pH值達(dá)4.2左右停止，確定浸米時(shí)間，以縮短傳統(tǒng)浸泡浸米時(shí)間。

蒸飯：處理后的大米淘洗干凈放到鍋中蒸70～90 min，蒸至無夾心、不沾粘、顆粒（較）松散。

淋飯、冷卻：用預(yù)先準(zhǔn)備好的冷卻水少量多次對其進(jìn)行降溫，冷卻至30 ℃左右。

糖漬桂花：干桂花放入質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的鹽水中浸泡5 min，然后控干水分。再大火蒸10 min。將等質(zhì)量的冰糖（食品級）加適量的水熬制成糖漿，將桂花倒入進(jìn)行翻拌。冷卻后裝罐并用蜂蜜封頂，放入冰箱冷藏7 d后使用。

接種：麥曲粉碎，將干米質(zhì)量2%～6%的麥曲及0.2%的酵母菌一同拌入米中，搭窩后，在其表面撒入2%～6%糖漬桂花[8，13，18]。

前發(fā)酵：糖化24 h后進(jìn)行翻拌，72 h后加入50%干米質(zhì)量的冷卻水，發(fā)酵結(jié)束的前24 h加入40%干米質(zhì)量的冷卻水，開始密封產(chǎn)醇，12 h后再加入40%干米質(zhì)量的冷卻水，共計(jì)加入130%干米質(zhì)量的冷卻水[8]，然后進(jìn)行過濾。

后發(fā)酵：撒入少量2%糖漬桂花，以增加酒中桂花的色、香、味，然后轉(zhuǎn)入18 ℃條件下發(fā)酵72 h[15]。

壓榨：用四層紗布過濾出酒體，裝入滅菌玻璃罐中。

澄清：將盛有酒的玻璃罐密封保存，并置于陰涼干燥處放置24 h。

煎酒：將盛有酒的玻璃罐用保鮮膜密封好，放入水浴鍋中加熱至90 ℃，并保溫20 min，即得桂花酒成品。

1.3.2 桂花酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以干米500 g為基準(zhǔn)，固定酵母添加量0.2%，以感官評價(jià)和酒精度為評價(jià)指標(biāo)，在麥曲添加量為0.4%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間192 h條件下考察糖漬桂花添加量（2%、3%、4%、5%、6%）對桂花酒品質(zhì)的影響；在糖漬桂花添加量4%，麥曲添加量0.4%，發(fā)酵時(shí)間192 h條件下考察發(fā)酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）對桂花酒品質(zhì)的影響；在糖漬桂花添加量4%，麥曲添加量0.4%，發(fā)酵溫度25 ℃，探究發(fā)酵時(shí)間（144 h、168 h、192 h、216 h、240 h）對桂花酒品質(zhì)的影響；在糖漬桂花添加量為4%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間192 h，探究麥曲添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）對桂花酒品質(zhì)影響。

1.3.3 桂花酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用Box-Behnken中心原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以糖漬桂花添加量（A）、麥曲添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為4個(gè)因素，桂花酒酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)考察各因素交互作用對桂花酒酒精度和感官評分的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 桂花酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of Osmanthus fragrans wine

1.3.4 測定方法

pH值：pH計(jì)測定；還原糖：按照GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》中直接滴定法測定[19]；酒精度：按照GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》中酒精計(jì)法測定[20]；總酸：按照GB 12456—2021《食品中總酸的測定》中酸堿指示劑滴定法[21]。

感官評定：邀請10位具有食品專業(yè)背景人員，參照GB/T 27588—2011《露酒》的標(biāo)準(zhǔn)對發(fā)酵桂花酒進(jìn)行感官評分（總分100分），取10人的平均分[22]，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 桂花酒的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory score criteria of Osmanthus fragrans wine

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌干預(yù)對浸米時(shí)間的影響

浸米是黃酒制作的前端工藝，將此程序應(yīng)用于桂花酒中，加快了大米的酸化過程，使大米膨脹，蒸煮縮短了工藝時(shí)間，而且降低桂花酒中的生物胺含量，提高飲后舒適感[17]。在浸泡大米的過程中，添加植物乳桿菌，其菌種快速繁殖以達(dá)到生酸，在漿水pH降至4.2左右，即可停止發(fā)酵[18]。由圖1可知，在18 ℃條件下，當(dāng)浸米時(shí)間60 h時(shí)漿水pH值接近4.2。因此，確定浸米的最佳時(shí)間是60 h。

圖1 植物乳桿菌干預(yù)對浸米時(shí)間的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum intervention on rice soaking time

2.2 桂花酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 糖漬桂花添加量對桂花酒品質(zhì)的影響

由圖2可知，桂花酒酒精度、感官評分隨糖漬桂花添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，糖漬桂花添加量為4%時(shí)桂花酒酒精度最高，為13.8% vol，此時(shí)感官評分為73.1分；糖漬桂花添加量為5%時(shí)桂花酒感官評分最高，為75.1分，此時(shí)酒精度為12.9% vol。當(dāng)糖漬桂花添加量＜4%時(shí)，可發(fā)酵糖量減少，桂花酒的酒精度和感官評分均較低；當(dāng)添加量＞4%時(shí)，可發(fā)酵糖量較多，酵母菌營養(yǎng)豐富迅速生長同時(shí)也快速衰亡[23]，致使酒精度和感官評分較低。因此，確定糖漬桂花添加量4%為最佳添加量。

2.2.2 麥曲添加量對桂花酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，桂花酒酒精度和感官評分隨著麥曲添加量的增加呈先升高后又略降低的趨勢。在麥曲添加量為0.4%時(shí)桂花酒感官評分、酒精度均最高，分別為74.9分、13.7% vol。當(dāng)麥曲添加量＜0.4%時(shí)，麥曲添加較少易被雜菌污染而發(fā)生變質(zhì)，當(dāng)添加量＞0.4%時(shí)，麥曲中的根霉菌快速生長而發(fā)生衰亡，使酒的苦味較明顯[24]。因此，確定麥曲添加量0.4%為最佳添加量。

圖3 麥曲添加量對桂花酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of wheat malt addition on the quality of Osmanthus fragrans wine

2.2.3 發(fā)酵溫度對桂花酒品質(zhì)的影響

由圖4可知，桂花酒酒精度和感官評分隨著發(fā)酵溫度的升高呈先升高后又略降低的趨勢。在發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)桂花酒感官評分、酒精度均最高，分別為77.5分、14.8% vol。當(dāng)發(fā)酵溫度低于30 ℃時(shí)，發(fā)酵進(jìn)行緩慢，且易被雜菌污染、滋味不協(xié)調(diào)；當(dāng)發(fā)酵溫度高于30 ℃時(shí)，高溫致使麥曲（中高溫曲）中的根霉菌和毛霉菌易成為優(yōu)勢菌，要及時(shí)進(jìn)行攪拌、散溫，否則會發(fā)酵失敗[25]。因此，確定發(fā)酵溫度30 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對桂花酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of O.fragrans wine

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對桂花酒品質(zhì)的影響

由圖5可知，桂花酒酒精度和感官評分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈先升高后又略降低的趨勢。在發(fā)酵時(shí)間為192 h時(shí)桂花酒感官評分、酒精度均最高，分別為76.4分、14.7% vol，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＜192 h時(shí)，發(fā)酵時(shí)間過短，發(fā)酵不充分、酒香不明顯、顏色淺黃渾濁暗淡；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞192 h后，發(fā)酵時(shí)間過長，酒精開始部分轉(zhuǎn)化為其他醇類、酯類、有機(jī)酸等，使酒精度降低[26]，影響口感。因此，確定發(fā)酵時(shí)間192 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對桂花酒品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the quality of Osmanthus fragrans wine

2.3 桂花酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3、表4可知，Y2模型中各因素交互作用均不顯著，因此只對酒精度（Y1）進(jìn)行分析。4個(gè)因素經(jīng)過擬合后得酒精度（Y1）的二次多元回歸方程為：Y1=15.48+0.50A+0.29B+0.19C+0.32D+0.025AB-0.100AC+0.33AD+0.37BC-0.13BD+0.20CD-0.69A2-0.38B2-0.65C2-0.84D2。由表5可知，Y1的回歸方程模型顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)P=0.076 6＞0.05不顯著，表示模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合度較好；決定系數(shù)R2=0.993 2，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9863，表明酒精度的實(shí)際值與預(yù)測值之間的擬合度較高[27-28]。4個(gè)因素對酒精度的影響順序：糖漬桂花添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞麥曲添加量＞發(fā)酵溫度。從分析中還可以看出，一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AD、BC、CD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AC和BD對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

表3 桂花酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation conditions optimization of Osmanthus fragrans wine

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression mode

2.4 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)，得出糖漬桂花添加量、麥曲添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間交互作用對桂花酒酒精度影響的響應(yīng)曲面和等高線，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，等高線呈橢圓形，說明糖漬桂花添加量和發(fā)酵溫度、糖漬桂花添加量和發(fā)酵時(shí)間、麥曲添加量和發(fā)酵溫度、麥曲添加量和發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間存在交互作用，與表4方差分析結(jié)果一致。

由圖6可知，隨著A（糖漬桂花添加量）和C（發(fā)酵溫度）的增加酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，A對應(yīng)的曲面坡度相較于C的陡峭，即A對酒精度的影響程度大于C，等高線呈橢圓形，表示A和C交互作用顯著；隨著A（糖漬桂花添加量）和D（發(fā)酵時(shí)間）的增加酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，A對應(yīng)的曲面坡度相較于D的陡峭，即A對酒精度的影響程度大于D，等高線呈橢圓形，表示糖漬A和D交互作用極顯著（P＜0.01）；隨著B（麥曲添加量）和C（發(fā)酵溫度）的增加酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，C對應(yīng)的曲面坡度相較于B的陡峭，即C對酒精度的影響程度大于B，等高線呈橢圓形，表示B和C交互作用極顯著（P＜0.01）；隨著B（麥曲添加量）和D（發(fā)酵時(shí)間）的增加酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，D對應(yīng)的曲面坡度相較于B的陡峭，即D對酒精度的影響程度大于B，等高線呈橢圓形，表示B和D交互作用顯著（P＜0.05）；隨著C（發(fā)酵溫度）和D（發(fā)酵時(shí)間）的增加酒精度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，D對應(yīng)的曲面坡度相較于C的陡峭，即D對酒精度的影響程度大于C，等高線呈橢圓形，表示C和D交互作用極顯著（P＜0.01）。

圖6 各因素交互作用對桂花酒酒精度影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on alcohol content of Osmanthus fragrans wine

最終得到最優(yōu)工藝參數(shù)：生酸過程為植物乳桿菌添加量0.1%，18 ℃條件下發(fā)酵60 h；發(fā)酵過程為糖漬桂花添加量5%，麥曲添加量0.3%，固定酵母添加量0.2%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間192 h。

2.5 模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型具有可行性，用得到的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)得到桂花酒酒精度為14.61% vol，感官評分達(dá)到81.9分。酒精度與預(yù)測值（14.50% vol）相對誤差為0.007 8，模型不顯著（P＞0.05），模型驗(yàn)證成功，桂花酒品質(zhì)工藝優(yōu)化是可行的，得到的工藝參數(shù)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。最后測得成品桂花酒糖度（以葡萄糖計(jì)）為23 g/L，酸度（以乳酸計(jì)）為3.6 g/L，口感清爽，酒體金黃透亮。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)得出的桂花酒最佳工藝，即選擇自制優(yōu)質(zhì)干桂花，先制作成糖漬桂花，添加0.1%植物乳桿菌，大米進(jìn)行酸化，添加0.2%酵母、5%糖漬桂花、0.3%麥曲，在30 ℃發(fā)酵192 h，然后過濾，即可得到感官評分81.9分，酒精度為14.61% vol，糖度為23 g/L（以葡萄糖計(jì)），酸度3.6 g/L（以乳酸計(jì)）的桂花酒。桂花酒有著濃郁的桂花香氣，諸香和諧純正，口感清爽，酒體呈金黃透亮。

傳統(tǒng)黃酒生產(chǎn)工藝，在發(fā)酵前期加入了新鮮桂花，使得酒精度介于12% vol～13% vol，糖度（以葡萄糖計(jì)）45～50 g/L，總酸（以乳酸計(jì)）4.5～6.5 g/L。本試驗(yàn)的結(jié)果中酒精度較高，糖度較低，酸度較低，口感清爽，酒液清亮，如何將酒精度降低至12% vol～13% vol、提升殘?zhí)沁€有待進(jìn)一步研究，在積極改善桂花酒的口感的同時(shí)且不失營養(yǎng)功效，在降低成本的同時(shí)提高附加值，為桂花酒的研究提供了一定的基礎(chǔ)，且有益于本地經(jīng)濟(jì)發(fā)展。