不同殺菌條件下蘋果醋風味、營養(yǎng)及活性成分的變化

馬艷蕊，于 紅，初 樂，趙 巖，朱風濤，和法濤，范 琳，劉光鵬*

（1.中華全國供銷合作總社 濟南果品研究院，山東 濟南 250200；2.威海職業(yè)學院 康養(yǎng)學院，山東 威海 264210）

蘋果具有豐富的營養(yǎng)成分，富含粗纖維素、多糖、維生素、多酚、人體必需的微量元素等[1-5]，是日常生活中最受人們喜愛的水果之一。隨著蘋果種類的不斷豐富，種植面積的不斷擴大，我國蘋果產(chǎn)量也日漸攀升，2020年全國蘋果產(chǎn)量達4 100萬t，隨之出現(xiàn)的蘋果精深加工產(chǎn)業(yè)日漸完善，在滿足人們多樣化食用需求的同時，也逐步實現(xiàn)了蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6]。

蘋果醋是以鮮蘋果或蘋果汁為原料，經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵后得到的一種健康飲品，不僅風味優(yōu)良，而且兼有水果和食醋的營養(yǎng)和保健效用[7-8]。蘋果醋中富含有機酸、維生素、氨基酸、果膠、礦物質(zhì)等成分[9-11]，具有改善血液循環(huán)、抵抗病菌侵害、對抗關(guān)節(jié)炎、延緩衰老、促進消化、美容護膚、防止血壓升高和動脈硬化、排除毒素、調(diào)節(jié)鈣質(zhì)代謝等多種保健功效[12-14]。隨著人們對食品要求的不斷提高，蘋果醋產(chǎn)品日漸受到消費者的青睞。

蘋果醋中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)、營養(yǎng)及活性成分含量是決定蘋果醋風味的關(guān)鍵，也是決定蘋果醋品質(zhì)的重要因素[15]，在以往的研究中，人們多關(guān)注于發(fā)酵工藝對蘋果醋風味的影響，而殺菌作為蘋果醋生產(chǎn)中的必要環(huán)節(jié)，其對蘋果醋風味的影響研究鮮有報道。鄧娜娜[16]研究了加熱、超聲波、微波三種殺菌方式對桑葚醋風味的影響，結(jié)果表明微波殺菌后的桑葚醋香氣品質(zhì)最好，但由于微波殺菌成本較高，不適于在果醋加工產(chǎn)業(yè)中廣泛應用。熱力殺菌是蘋果醋生產(chǎn)過程中最常用的殺菌方式，主要的熱力殺菌方式有：低溫長時（low temperature long time，LTLT）殺菌、高溫短時（high temperature short time，HTST）殺菌及超高溫瞬時（ultra high temperature short time，UHTS）殺菌等。LTLT殺菌法也稱為巴氏殺菌，處理溫度通常在100 ℃以下，典型的巴氏殺菌的條件是62.8 ℃、30 min，LTLT殺菌簡單、方便，殺菌效果達99%，致病菌完全被殺死，但不能殺死嗜熱、耐熱性細菌、孢子，以及一些殘存的酶類。HTST殺菌是指100 ℃以上，130 ℃以下的殺菌處理，其加熱時間短，營養(yǎng)成分損失少，處理量大，適于連續(xù)化生產(chǎn)，節(jié)省熱源，成本低。UHTS殺菌是指130～150 ℃持續(xù)時間幾秒的處理，UHTS殺菌溫度高，殺菌時間極短，殺菌效果顯著，引起的化學變化少，但設(shè)備成本較高。不同的加熱方式、加熱溫度、加熱時間都會對蘋果醋的揮發(fā)性香氣成分、營養(yǎng)及活性成分含量產(chǎn)生很大影響。本研究擬采用HTST殺菌方式對蘋果醋原液進行殺菌處理，并探究不同殺菌溫度和殺菌時間下蘋果醋中風味、營養(yǎng)及活性成分的變化，深入了解HTST殺菌對蘋果醋品質(zhì)影響，為蘋果醋的殺菌技術(shù)提供科學依據(jù)，對蘋果醋生產(chǎn)中穩(wěn)定品質(zhì)具有實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

新鮮蘋果：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BV818：安琪酵母股份有限公司；弱氧化醋酸桿菌（Acetobacter suboxydans）（滬釀1.01）：本實驗室保藏。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖（分析純）、無水硫酸鎂（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；碳酸鈣、氫氧化鈉、硝酸鋁（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；酵母膏（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；磷酸二氫鉀（分析純）：天津市廣成化學試劑有限公司；瓊脂（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

醋酸菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1.5%，磷酸二氫鉀0.05%，無水硫酸鎂0.05%，pH自然，121 ℃滅菌20 min后冷卻至室溫，加入體積分數(shù)為3%的乙醇。

醋酸菌固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏1%，碳酸鈣2%，瓊脂2%，pH自然，121 ℃滅菌20 min后冷卻至50 ℃左右，加入體積分數(shù)為3%的乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LX-100A高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；ST-20高溫殺菌設(shè)備：上海順儀實驗設(shè)備有限公司；SWCJ-2FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RS-232恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；BIOF-6010B/S/B/Z微生物發(fā)酵罐：上海高機生物工程有限公司；6890N-5973N氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS）儀：美國安捷倫（中國）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌的活化

在無菌條件下，從菌種保藏斜面中挑取一環(huán)醋酸菌菌種，以劃線方式在醋酸菌固體培養(yǎng)基上進行活化，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d。從固體平板上挑取活化后的菌種接入50 mL醋酸菌液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)過夜，制成一級種子液。取15 mL一級種子液接入300 mL滅菌后的蘋果汁中，置于30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)過夜，制成二級種子液。

1.3.2 蘋果醋的制備

將鮮蘋果破碎壓榨過濾取汁，加熱至90 ℃殺菌后灌入發(fā)酵罐中，按0.2‰接種量接入活性干酵母，30 ℃條件下靜置發(fā)酵5～7 d，直至殘?zhí)墙抵?.4%以下，得到蘋果酒。將蘋果酒用硅藻土進行過濾，盡量去除酵泥，按10%的接種量接入上步制得的醋酸菌二級種子液，設(shè)定發(fā)酵罐溫度為30 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1 200 r/min，通風速率為2 L/min發(fā)酵3～4 d，直至發(fā)酵液的酸度不再上升，設(shè)置不同條件進行殺菌處理，得到蘋果醋。

1.3.3 殺菌條件的設(shè)計

如表1所示，設(shè)定五種不同殺菌條件，五種殺菌條件處理后的蘋果原醋均能達到商業(yè)無菌要求，其中樣品S1為未經(jīng)過殺菌處理的對照組。

表1 蘋果醋樣品殺菌條件的設(shè)計Table 1 Design of sterilization conditions for apple vinegar samples

1.3.4 分析檢測

（1）揮發(fā)性香氣成分的測定

蘋果醋中揮發(fā)性香氣成分測定采用GC-MS法。準確稱取5.00 g果醋置于20 mL樣品瓶中，加入10 μL質(zhì)量濃度為32.88 μg/mL的2-辛醇內(nèi)標，加蓋密封，待測。

GC分析條件：DB-5MS色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（純度99.999%）；流速1.660 mL/min，不分流；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持8 min。

MS條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度為280 ℃，四級桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，掃描范圍為50～600 m/z。

（2）總酚測定

采用福林-肖卡法（Folin-Ciocalteu）對蘋果醋中總酚含量進行測定[17]。

（3）總黃酮測定

參考范祺等[18]的硝酸鋁顯色法對蘋果醋中總黃酮含量進行測定，略有改動。準確稱取蘆丁標準品0.010 0 g，用體積分數(shù)為50%的乙醇溶解并定容至100 mL，制備成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。用移液槍分別吸取0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL的蘆丁標準液置于試管中，用體積分數(shù)為50%的乙醇稀釋補充至2.5 mL，漩渦混勻后加入5%的NaNO2溶液0.15 mL，搖勻后靜置6 min，加入10%的Al（NO3）3溶液0.15 mL，漩渦混勻，室溫放置6 min，隨后加入1 mol/L的NaOH溶液2 mL，搖勻，在波長510 nm處測定吸光度值，得到以蘆丁標準液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標的標準曲線，標準曲線方程式為：y=0.005 5x-0.003 6（R2=0.999 5），按照標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮的含量。

（4）抗壞血酸測定

參考國標GB 5009.86—2016《食品中抗壞血酸的測定》中的2,6-二氯靛酚滴定法。

（5）有機酸測定

參考國標GB 5009.157—2016《食品中有機酸的測定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌條件下蘋果醋中營養(yǎng)及活性成分含量的變化

經(jīng)過檢測分析，六種樣品中的營養(yǎng)及活性成分含量測定結(jié)果見圖1。由圖1A可知，與對照樣S1相比，殺菌后樣品的總酸含量變化并不顯著（P＞0.05）；由圖1B可知，與對照樣S1相比，樣品S2和S3總酚含量變化不顯著（P＞0.05），而樣品S4、S5及S6總酚含量顯著降低（P＜0.05）；由圖1C可知，與對照樣S1相比，樣品S2、S3及S4抗壞血酸含量變化不顯著（P＞0.05），樣品S5抗壞血酸含量顯著降低（P＜0.05），樣品S6抗壞血酸含量極顯著降低（P＜0.01）；由圖1D可知，與對照樣S1相比，樣品S2和S4總黃酮含量變化不顯著（P＞0.05），而樣品S3、S5及S6總黃酮含量顯著降低（P＜0.05），說明隨著溫度的升高，會對酚類物質(zhì)、抗壞血酸和黃酮產(chǎn)生破壞，致使含量下降[19]。由圖1E可知，與對照樣S1相比，除樣品S5蘋果酸含量顯著增加（P＜0.05），其余樣品蘋果酸含量變化不顯著（P＞0.05）。與對照樣S1相比，所有樣品檸檬酸含量均有極顯著增加（P＜0.01），可能是由于高溫使得檸檬酸鹽分解。

圖1 不同殺菌條件下蘋果醋中營養(yǎng)及活性成分含量的變化Fig.1 Changes of nutrition and active ingredients contents in apple vinegar under different sterilization conditions

總體來說，過高的殺菌溫度會對蘋果醋中的營養(yǎng)及活性成分含量產(chǎn)生較大影響，較低的殺菌溫度對蘋果醋中有機物含量的變化影響較小，結(jié)合圖1中數(shù)據(jù)，100 ℃、30 s條件下殺菌對蘋果醋中的營養(yǎng)及活性成分含量影響較小，為較佳殺菌條件。

2.2 不同殺菌條件下蘋果醋中揮發(fā)性香氣成分的變化

經(jīng)過GC-MS 檢測，不同殺菌條件下6種樣品中的揮發(fā)性香氣成分含量測定結(jié)果見表2。由表2可知，在不同殺菌條件下的6種蘋果醋樣品中共檢測到50種揮發(fā)性香氣成分，其中有35種共有物質(zhì)。未經(jīng)殺菌處理的蘋果醋樣品S1中共檢測到38種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類15種，占比65.48%；酸類5種，占比9.96%；醇類8種，占比12.54%；醛類2種，占比0.88%；烴類2種，占比0.19%；酮類1種，占比0.17%；其他類5種，占比10.78%。樣品S2中共檢測到40種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類16種，占比61.53%，酸類5種，占比10.00%，醇類7種，占比13.83%，醛類2種，占比1.03%，烴類4種，占比1.75%，酮類1種，占比0.19%，其他類5種，占比10.79%。樣品S3中共檢測到41種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類15種，占比62.22%，酸類5種，占比9.93%，醇類8種，占比13.12%，醛類2種，占比1.58%，烴類2種，占比0.18%，酮類2種，占比0.49%，其他類7種，占比12.27%；樣品S4中共檢測到39種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類15種，占比61.32%，酸類5種，占比9.83%，醇類7種，占比13.10%，醛類2種，占比1.87%，烴類1種，占比0.09%，酮類2種，占比0.31%，其他類7種，占比12.48%；樣品S5中檢測到42種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類15種，占比57.91%，酸類5種，占比13.39%，醇類9種，占比13.74%，醛類2種，占比1.97%，烴類3種，占比0.41%，酮類2種，占比0.30%，其他類6種，占比13.48%；樣品S6中共檢測到46種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類17種，占比56.94%，酸類5種，占比12.69%，醇類11種，占比16.68%，醛類2種，占比2.01%，烴類3種，占比0.43%，酮類2種，占比0.29%，其他類6種，占比10.97%。由此可見，酯、醇、酸類物質(zhì)是蘋果醋中主要的揮發(fā)性香氣成分，其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、正戊醇、苯乙醇、乙酸、仲丁基醚是對蘋果醋風味貢獻較大的特征香氣成分。

表2 不同殺菌條件下蘋果醋中揮發(fā)性香氣成分含量檢測結(jié)果Table 2 Determination results of volatile aroma components in apple cider vinegar under different sterilization conditions mg/L

續(xù)表

續(xù)表

2.2.1 酸、醇、酯類物質(zhì)變化

有機酸是蘋果醋中主要的呈酸物質(zhì)，包括蘋果酸、乙酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸等，乙酸是主要揮發(fā)性酸[20]，主要是由醋酸桿菌利用乙醇產(chǎn)生的[16]。在本實驗的六個樣品中均有乙酸檢出，但含量比較少，可能是在發(fā)酵過程中乙酸轉(zhuǎn)化生成了其他的香氣成分[21]。經(jīng)過殺菌處理后大部分樣品中的酸類物質(zhì)有不同程度的上升，總體呈隨殺菌溫度升高而提高的趨勢，其中，醋樣S2和S3和醋樣S1中的酸類物質(zhì)含量接近。分析其原因可能是在高溫條件下酯類物質(zhì)分解，導致酸類物質(zhì)含量升高。

與對照醋樣相比，經(jīng)過不同殺菌條件處理后的蘋果醋樣品的醇類物質(zhì)總含量均有所上升，其中正戊醇和苯乙醇含量上升明顯，這可能是由于殺菌過程中的熱能使一些結(jié)合醇中的糖苷健斷裂[22]，或是氨基酸的去氨基及去碳酸基反應使樣品中的醇類物質(zhì)含量升高[23]。

酯類物質(zhì)是蘋果醋中檢測到含量最多的一種化合物，常具有花香或果香，乙酸乙酯是其中含量最高的一種酯，除醋樣S2外，其他殺菌條件下的醋樣中乙酸乙酯含量均有所提升，這與樣品中乙酸含量的高低有直接聯(lián)系。而只有醋樣S2中產(chǎn)生了具有青香、藥草香、漿果香的己酸己酯，只有醋樣S6中產(chǎn)生了苯乙酸乙酯?？傮w來說，經(jīng)過殺菌處理后的蘋果醋樣品中的酯類物質(zhì)總含量與對照相比均有所下降，原因可能是加熱處理讓酯類物質(zhì)產(chǎn)生了分解反應，同時生成了部分醇類和酸類物質(zhì)[24]。

2.2.2 酮、醛、烴類物質(zhì)變化

酮類物質(zhì)一般呈脂肪味和焦燃味，隨著碳鏈的增長呈現(xiàn)出強的花香特征，蘋果醋經(jīng)過殺菌后酮類物質(zhì)含量均有所提升，除醋樣S2外，其他殺菌條件下處理的蘋果醋樣品中均檢測到3,4-二甲基-2-戊酮，具有強烈玫瑰花香氣的大馬士酮的含量也隨著殺菌溫度的升高而提升，可能是由于高溫產(chǎn)生的熱效應，增強了分子的活化能，促進了氧化反應。

與對照相比，殺菌后樣品中的醛類物質(zhì)含量有明顯的升高。苯甲醛具有苦杏仁味，會給蘋果醋香氣帶來不利影響，其含量呈隨溫度升高而升高的趨勢，可能是由于加熱處理后有效激活了糖苷酶的活性，從而水解糖苷類物質(zhì)，使以糖苷類結(jié)合的苯甲醛游離[21]，因此蘋果醋的殺菌溫度不宜設(shè)定過高。

不同的殺菌條件對蘋果醋中烴類物質(zhì)的含量影響較大，其中只有在醋樣S2中檢測到α-法尼烯的產(chǎn)生，其具有強烈的花香氣味。

在本實驗各樣品中，酯類物質(zhì)的含量高、種類多；酸類與醇類也是蘋果醋中的主要揮發(fā)性香氣成分，醛類、烴類和酮類的含量較少，這一結(jié)論與前人的研究結(jié)果一致[25-26]。隨著殺菌溫度的升高，酯類物質(zhì)在揮發(fā)性香氣成分中的占比總體呈下降趨勢，醋樣S1和S2中酯類物質(zhì)含量相對較高，且其他種類物質(zhì)含量與對照樣相比變化較小，為較適宜的殺菌條件。

3 結(jié)論

不同的殺菌條件會對蘋果醋中營養(yǎng)、活性成分和揮發(fā)性香氣成分的變化產(chǎn)生較大影響?？傮w來說，較低的殺菌溫度對蘋果醋中總酸、總酚、黃酮、抗壞血酸、蘋果酸的含量影響不大，揮發(fā)性香氣成分含量小有浮動，隨著殺菌溫度的升高，酯類物質(zhì)的含量明顯下降，而酸類、醇類和醛類物質(zhì)的含量呈上升趨勢，因此殺菌溫度不宜過高，以免破壞蘋果醋的風味體系。結(jié)合對不同殺菌條件下蘋果醋中營養(yǎng)、活性成分和揮發(fā)性香氣成分的分析，得出100 ℃，30 s殺菌條件下蘋果醋中的營養(yǎng)、活性成分及揮發(fā)性香氣成分含量相對其他殺菌條件變化較小，為較佳殺菌條件。

蘋果醋的感官特征是由各種不同的有機物質(zhì)和揮發(fā)性香氣成分協(xié)調(diào)作用所產(chǎn)生的，六種蘋果醋樣品檢測出50種風味成分，而共有的風味成分僅35種，這說明不同的殺菌條件下蘋果醋中的風味成分含量會產(chǎn)生較大變化，進而影響蘋果醋的品質(zhì)。因而，殺菌條件對蘋果醋的影響及其香氣特征需要進一步的研究，以便為蘋果醋品質(zhì)的提升及感官評價體系的建立提供更加科學的參考依據(jù)。