頂空固相微萃取GC-MS法分析8種獼猴桃果酒成分

劉志剛，韓琳，謝曉林，何鈴鈺，陶丹

（1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽550005；2.貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所，貴州貴陽550002）

獼猴桃果酒是以新鮮獼猴桃果實或果汁為原料，經(jīng)發(fā)酵而成的一種低度酒，由于其具有獼猴桃果香、酵香和醇香，風(fēng)味獨特并富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，在眾多果酒產(chǎn)品中獨樹一幟，市場前景廣闊[1-3]。果酒香氣成分是果酒感官質(zhì)量評價的重要指標(biāo)，我國獼猴桃品種繁多，生產(chǎn)工藝多有不同，導(dǎo)致市售獼猴桃果酒風(fēng)格各異，如何最大限度地保持果酒原有風(fēng)味是提高果酒品質(zhì)，增加產(chǎn)品附加值的重要途徑[4-6]。有學(xué)者對不同釀酒酵母發(fā)酵獼猴桃果酒的香氣物質(zhì)、釀造工藝和品質(zhì)評價開展了研究[7-9]，而有關(guān)不同品種獼猴桃果酒的系統(tǒng)研究相對較少。頂空固相微萃取技術(shù)（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）集濃縮、萃取、采樣和進(jìn)樣于一體，不需有機(jī)溶劑，分析所需樣品量少，通過與氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用，可快速準(zhǔn)確地對香氣物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，彌補(bǔ)了單一感官評價主觀性強(qiáng)、無法定量的缺點[10-12]，現(xiàn)已發(fā)展成為揮發(fā)性物質(zhì)分析測定最有效的手段之一，廣泛應(yīng)用于葡萄酒、茶葉等食品中香氣物質(zhì)的研究[13-15]。本研究擬采用頂空-固相微萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS法分析8種市售獼猴桃果酒產(chǎn)品的香氣成分，研究不同品種獼猴桃果酒在香氣物質(zhì)上的差異和規(guī)律，為獼猴桃果酒評價分級和釀造工藝升級提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

獼猴桃果酒樣品：市售，包括紅心、貴長、秦美、軟棗、徐香等獼猴桃品種，具體來源見表1。

表1 試驗材料Table 1 Samples information

1.2 儀器與設(shè)備

QP 2010型GC-MS聯(lián)用儀：日本島津公司；固相微萃取裝置、SPME萃取頭：美國Supelco公司；PC-420D磁力攪拌器：美國康寧公司；MA110型分析天平：上海良平儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

分別精密量取各獼猴桃果酒樣品8.0 mL置于頂空瓶中，編號后用移液管分別移取2.0 mL配制好的0.2 g/mL氯化鈉溶液于頂空瓶中，備用。

1.3.2 香氣物質(zhì)的吸附與解吸

事先將萃取頭于200℃下老化40 min，開啟磁力攪拌裝置，萃取頭穿過頂空瓶封墊懸空于液面上方，推出纖維頭后吸附30 min，收回纖維頭后將萃取頭插入GC-MS儀進(jìn)樣口，之后再次推出纖維頭，于250℃解吸附8 min。

1.3.3 SPME參數(shù)優(yōu)化

采用單因素試驗優(yōu)化獼猴桃果酒香氣物質(zhì)頂空固相微萃取條件。分別比較了7 μm和30 μm涂層厚度鍵合型PDMS及85 μm涂層厚度PA固相微萃取頭的萃取效果，氯化鈉溶液濃度設(shè)定為 0、0.1、0.2、0.3g/mL，萃取時間設(shè)定為 20、30、40、50min，萃取溫度設(shè)定為30、40、50、60℃，分析以上因素對萃取香氣成分的影響。

1.3.4 GC-MS分析條件

GC 條件：Rtx-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛細(xì)管柱；He氣為載氣，純度大于99.999%，色譜柱流量1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣；起始柱溫為40℃，保持3 min，以5℃/min升到120℃，以8℃/min升到230℃，保持10 min。

MS條件：電子轟擊離子源（EI），正離子模式，離子源溫度200℃，電子能量70 eV，接口溫度250℃，溶劑延遲時間6 min，質(zhì)量掃描范圍m/z 40～550。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)GC-MS分析后得到各樣品的總離子流色譜圖（total ion current chromatogram，TIC），經(jīng)NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索并從中挑選出匹配度≥85%的色譜峰，通過分析基峰、質(zhì)核比和相對豐度等信息[12-14]，確定各色譜峰對應(yīng)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，以各組分峰面積占總峰面積的百分比表示其相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣物質(zhì)捕集條件的優(yōu)化

2.1.1 固相微萃取頭的選擇

固相微萃取頭種類對香氣物質(zhì)捕集效果有顯著影響[16-18]，各固相微萃取頭所獲得色譜如圖1所示。

圖1 萃取頭種類對峰數(shù)目的影響Fig.1 Effect of extraction head type on peak numbers

由圖1可知，通過對7 μm、30 μm涂層厚度鍵合型PDMS和85 μm涂層厚度PA 3種不同類型固相微萃取頭捕集獼猴桃果酒成分的比較分析，結(jié)果表明，30 μm PDMS萃取頭捕集得到268個色譜峰，遠(yuǎn)高于7 μm涂層厚度鍵合型PDMS的133個色譜峰和85 μm涂層厚度PA固相微萃取頭205個色譜峰，因此本試驗選用30 μm PDMS固相微萃取頭。

2.1.2 添加電解質(zhì)（NaCl）對萃取效果的影響

有研究表明，向固相微萃取樣品中加入氯化鈉等電解質(zhì)溶液有助于提高試樣中有機(jī)物的逸出活度，從而促進(jìn)香氣物質(zhì)從液態(tài)基體中揮發(fā)并被吸附到萃取頭上[19-20]。本試驗中氯化鈉溶液濃度設(shè)定0、0.1、0.2、0.3g/mL 4個水平，氯化鈉濃度對峰數(shù)目的影響見圖2。

圖2 氯化鈉濃度對峰數(shù)目的影響Fig.2 Effect of sodium chloride concentration on peak numbers

由圖2可以看出，添加氯化鈉溶液可以顯著增加獼猴桃果酒試樣香氣物質(zhì)的捕集數(shù)量，并且隨著氯化鈉濃度的增加，萃取所得色譜峰數(shù)目顯著上升，當(dāng)氯化鈉濃度達(dá)到0.2 g/mL時，色譜峰數(shù)目達(dá)到峰值142個，之后隨著氯化鈉濃度的增加色譜峰數(shù)目又呈下降趨勢，綜上考慮，確定添加氯化鈉濃度為0.2 g/mL。

2.1.3 萃取溫度的確定

采用30 μm PDMS固相微萃取頭，分別于30、40、50、60℃條件下對紅心獼猴桃果酒中香氣成分進(jìn)行捕集（以六盤水涼都紅心獼猴桃果酒為例），采用色譜圖歸一化法所得“總峰面積”和“總峰面積與色譜峰數(shù)目比值”兩個參數(shù)來評價萃取條件優(yōu)化結(jié)果，從而兼顧香氣成分中主要物質(zhì)和含量較低成分的評價，結(jié)果見圖3。

圖3 萃取溫度對總峰面積和總峰面積與峰數(shù)比值的影響Fig.3 Effect of adsorption temperature on total peak area and total peak area to peak number ratio

由圖3可以看出，隨著萃取溫度的上升，萃取所得色譜峰總峰面積和總峰面積與色譜峰數(shù)目比值兩項參數(shù)均有所增加，在40℃時達(dá)到峰值，之后吸附逐漸趨于飽和，上述參數(shù)均大幅下降，最終確定萃取溫度為40℃。

2.1.4 萃取時間的確定

采用30 μm PDMS固相微萃取頭，在40℃萃取溫度下，分別吸附紅心獼猴桃果酒試樣（以六盤水涼都紅心獼猴桃果酒為例）20、30、40、50 min，采用色譜圖歸一化法所得“總峰面積”和“總峰面積與色譜峰數(shù)目比值”兩個參數(shù)來評價萃取條件優(yōu)化結(jié)果，具體結(jié)果見圖4。

圖4 萃取時間對總峰面積和總峰面積與峰數(shù)比值的影響Fig.4 Effect of adsorption time on total peak area and total peak area to peak number ratio

由圖4可以看出，隨著萃取時間的延長，香氣物質(zhì)的吸附量逐漸增加，萃取所得色譜峰總峰面積和總峰面積與色譜峰數(shù)目比值兩項參數(shù)均有所增加，在40 min時達(dá)到峰值，之后吸附逐漸趨于飽和，上述參數(shù)均有所下降，最終確定萃取時間為40 min。

2.2 香氣成分的GC-MS分析

采用優(yōu)化后的HS-SPME條件捕集不同品種獼猴桃果酒中的揮發(fā)性物質(zhì)，圖5為經(jīng)GC-MS儀分析得到8個獼猴桃果酒樣品總離子流圖。

圖5 獼猴桃果酒香氣成分GC/MS總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of aromatic components extract from kiwifruit wines

TIC數(shù)據(jù)經(jīng)NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，人工圖譜解析，并查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)，篩選出匹配度不小于82%的色譜峰，以各組分峰面積占總峰面積的百分比表示其相對含量。不同品種市售獼猴桃果酒中檢出揮發(fā)性物質(zhì)均在80種以上，通過文獻(xiàn)比對確定其中主要香氣物質(zhì)，表2中所列為各種獼猴桃果酒中相對含量較高的6種共有香氣物質(zhì)含量。

表2 不同品種獼猴桃果酒主要共有香氣成分差異Table 2 Difference of main aromatic components of kiwifruit wines

由表2可知，香氣物質(zhì)主要有酯類、醇類和酸類物質(zhì)等。不同品種獼猴桃果酒中相對含量較高的共有香氣物質(zhì)主要有辛酸乙酯、癸酸乙酯、正己酸乙酯和丁二酸二乙酯等，但不同品種獼猴桃果酒中上述香氣物質(zhì)含量差異很大，其中辛酸乙酯和癸酸乙酯的高低含量相差均在20倍以上，正己酸乙酯和丁二酸二乙酯差距8倍左右，而苯乙醇含量差距最小。此外，四川蒼溪“紅心”獼猴桃果酒中2-氨基-5-甲基苯甲酸（4.3%），貴州六盤水涼都“紅心”獼猴桃果酒中糠醛（4.1%），貴州修文“貴長”獼猴桃果酒中5-羥甲基糠醛（3.1%），遼寧桓仁“軟棗”獼猴桃果酒中山梨酸乙酯（5.2%），河南西峽野生獼猴桃果酒鄰苯二甲酸二異丁酯（3.8%），福建泉州“徐香”獼猴桃果酒中3-甲基-1-丁醇（8.7%）等香氣物質(zhì)在其它品種果酒中未檢出或含量極低。表3所列為涼都紅心獼猴桃果酒中香氣物質(zhì)示例，共檢出70種香氣物質(zhì)，其中含量高于0.1%的物質(zhì)有49種。

表3 涼都紅心獼猴桃果酒主要香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 3 GC-MS analytical results of main aromatic components of Liangdu kiwifruit wine

續(xù)表3 涼都紅心獼猴桃果酒主要香氣成分GC-MS分析結(jié)果Continue table 3 GC-MS analytical results of main aromatic components of Liangdu kiwifruit wine

3 討論與結(jié)論

果酒香氣物質(zhì)常規(guī)評價方法是感官評價法，近年來電子鼻和頂空固相微萃取等方法應(yīng)用日益廣泛，通過將頂空固相微萃?。℉S-SPME）技術(shù)與GC-MS聯(lián)用，可快速準(zhǔn)確地對果酒中為數(shù)眾多的微量香氣物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。本研究中，優(yōu)化后選用30 μm PDMS微萃取頭，萃取時間40 min、萃取溫度40℃和0.2 g/mL氯化鈉濃度為萃取條件，可用于8種獼猴桃果酒中香氣成分的提取。

GC-MS分析結(jié)果表明，不同品種獼猴桃果酒的揮發(fā)性成分均在80種以上，通過文獻(xiàn)比對確定其主要香氣物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)酯類物質(zhì)為構(gòu)成獼猴桃果酒中香氣物質(zhì)的主力，此外醇類和酸類較多，醛酮類和酚類物質(zhì)較少，其中修文貴長獼猴桃果酒和西峽野生獼猴桃果酒中未檢出酚類香氣物質(zhì)。不同品種獼猴桃果酒中各主要香氣成分相對含量有明顯差異，以涼都紅心獼猴桃果酒為例，共檢出含量高于0.1%的香氣物質(zhì)49種，酯類成分相對含量較高，主要有辛酸乙酯（9.35%）、乳酸乙酯（7.87%）和正己酸乙酯（6.48%）3種，醇類成分種類多達(dá)14種，占總峰面積的29.62%，含量較高的有順-3-己烯醇（10.31%）、苯乙醇（4.93%）、苯甲醇（4.39%）和1-戊醇（4.25%）等，醛類9種，占22.53%，烷烴類14種，占11.07%，酮類物質(zhì)9種，占4.52%，此外還含有烯烴5種，其它類3種。蒼溪紅心、周至秦美、泉州徐香和西峽野生獼猴桃果酒相對含量最高的香氣物質(zhì)分別為山梨酸乙酯（34.73%）、癸酸乙酯（13.86%）、辛酸乙酯（28.34%）和苯甲酸乙酯（11.58%），六枝紅心和修文貴長獼猴桃果酒相對含量最高的香氣物質(zhì)均為3-甲基-1-丁醇，而軟棗獼猴桃果酒相對含量最高的香氣物質(zhì)為糠醛。有學(xué)者研究表明[19]，大多數(shù)酯類具有花、果香氣，如正己酸乙酯具有水果香味，而苯乙醇具有玫瑰香、紫羅蘭香、茉莉花香等多種風(fēng)味，可能是構(gòu)成獼猴桃酒香氣的主要成分之一[21]。上述結(jié)果表明，不同品種獼猴桃果酒中香氣物質(zhì)的主體均為酯類、醇類和酸類物質(zhì)，醛酮類和酚類物質(zhì)相對較少，但不同來源獼猴桃果酒所含有風(fēng)味物質(zhì)差異較大從而體現(xiàn)出各自獨特的風(fēng)味，本研究旨在為獼猴桃果酒感官質(zhì)量評價體系的完善和獼猴桃果酒產(chǎn)品的開發(fā)提供參考，從而進(jìn)一步拓展獼猴桃資源的利用領(lǐng)域。