混合酵母發(fā)酵對(duì)火龍果酒發(fā)酵特性及風(fēng)味特征的影響

林亞蘭，張愛華

（1.常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇常州213164；2.常州大學(xué)城鄉(xiāng)礦山研究院，江蘇常州 213164）

我國火龍果酒的生產(chǎn)過程多采用商用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行單菌發(fā)酵，釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中耐高酒精、高溫，有良好的發(fā)酵活性，可以確保果酒品質(zhì)的穩(wěn)定，但由于釀酒酵母代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性香味物質(zhì)種類少且含量低，缺乏酯類香味物質(zhì)，不能很好地體現(xiàn)果酒的復(fù)雜性和典型性[1-2]，難以滿足消費(fèi)者需求。大量研究表明，非釀酒酵母在葡萄酒釀制過程中，通過與釀酒酵母的共同發(fā)酵來控制酒體不理想的風(fēng)味或者降低乙醇含量來賦予葡萄酒復(fù)雜的香氣，從而增加葡萄酒感官質(zhì)量特征的復(fù)雜性。這類酵母與釀酒酵母不同，它們可以產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)果酒品質(zhì)有著積極的影響[3-5]。檸檬形克勒克酵母（Klockera apiculata）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）具有高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力[6]，揮發(fā)性香氣形成主要依靠β-葡萄糖苷酶水解香氣糖苷[7]，β-葡萄糖苷酶具有獨(dú)特的水解活性，可以從香氣前體物質(zhì)的末端非還原性β-D-糖苷鍵中釋放出非還原性糖基，賦予葡萄酒更好的花香、果香味[8]。葡萄汁由孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）與釀酒酵母的混種發(fā)酵可有效改善果酒的品質(zhì)和風(fēng)味[9-10]。在麥芽汁中接種德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）增加了乙酸乙酯和乙酸異戊酯含量[11]，在果酒釀造過程中添加Torulaspora delbrueckii可以提高生物風(fēng)味并減少乙醇含量[12]。對(duì)于既不含有機(jī)酸，也不含酯類芳香因子的毫無風(fēng)味的火龍果而言，在釀造火龍果酒時(shí)可以引用非釀酒酵母來提升果酒風(fēng)味，以此提高火龍果酒的品質(zhì)。

我國火龍果釀造產(chǎn)業(yè)剛剛起步，非釀酒酵母在火龍果酒釀制過程中的作用尚未見報(bào)道，因此本研究選用非釀酒酵母德爾布有孢圓酵母與釀酒酵母混合，通過對(duì)火龍果酒發(fā)酵特性、香氣成分進(jìn)行研究，探討德爾布有孢圓酵母相關(guān)代謝物對(duì)火龍果酒風(fēng)味及感官特性的影響，以期為生產(chǎn)高質(zhì)量火龍果酒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮火龍果：貴州羅甸紅心火龍果；德爾布有孢圓酵母PRELUDE（非釀酒酵母）：CHR HANSEN公司；德爾布有孢圓酵母NS-D（非釀酒酵母）：安琪酵母公司，購入為活性干酵母；釀酒酵母RB2、X16、焦亞硫酸鉀（potassium metabisulfite，PMS）、酒石酸、果膠酶（3 280 U/g，以半乳糖醛酸計(jì)）、碳酸氫鉀、酵母營養(yǎng)助劑（均為食品級(jí)）：法國Laffort公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1手持糖度計(jì)：日本ATAGO公司；DMA35手持酒精測試儀：奧地利安帕公司；GC-MS-QP2010PLUS氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火龍果酒加工工藝流程

火龍果酒發(fā)酵工藝流程見圖1。

圖1 火龍果酒發(fā)酵工藝流程Fig.1 The fermentation process of pitaya wine

選擇成熟度高、無霉?fàn)€變質(zhì)及無病蟲害的新鮮火龍果，用1%H2O2沖洗、去皮，將果肉打漿。根據(jù)果漿的質(zhì)量添加果膠酶（3 g/100 kg），14℃～16℃條件下酶解24 h，紗布過濾除去果渣，根據(jù)所得的果汁體積添加蔗糖調(diào)整火龍果汁的糖度。接種前添加25 mg/L的SO2（以PMS的形式添加）。將4種酵母RB2、X16、PRELUDE、NS-D按3 g/L于30℃條件下用去離子水活化30 min，水體積為酵母體積20倍，當(dāng)酵母產(chǎn)生豐富氣泡時(shí)加入幾滴火龍果汁進(jìn)行酵母訓(xùn)化，將活化好的酵母接種在火龍果汁中，在16℃條件下進(jìn)行恒溫發(fā)酵，每天測定糖度、pH值等變化直至主發(fā)酵結(jié)束（當(dāng)火龍果酒酒體表面無氣泡產(chǎn)生，酵母生長量、殘?zhí)呛颗c酒精度等趨于穩(wěn)定說明主發(fā)酵結(jié)束）。主發(fā)酵結(jié)束后，將火龍果酒經(jīng)濾網(wǎng)過濾澄清，移入新的發(fā)酵容器于4℃進(jìn)行低溫陳釀，陳釀結(jié)束后移入容器儲(chǔ)存。

1.3.2 發(fā)酵性能試驗(yàn)

將火龍果汁進(jìn)行成分調(diào)整，最終白利糖度（Brix）為22°Bx，pH值為3.8，將果汁均分為8份，在20 L的不銹鋼發(fā)酵桶中進(jìn)行酒精發(fā)酵。酵母接種活菌數(shù)量為1×106CFU/mL，發(fā)酵溫度為16℃。分別進(jìn)行釀酒酵母（RB2、X16）和非釀酒酵母（PRELUDE、NS-D）的簡單發(fā)酵與混合發(fā)酵，混合發(fā)酵編號(hào)為CF1（RB2+PRELUDE）、CF2（RB2+NS-D）、CF3（X16+PRELUDE）、CF4（X16+NS-D）。

混合酵母發(fā)酵試驗(yàn)與單菌酵母發(fā)酵試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，混合酵母按體積比1∶1接種。每24 h收集一次樣品，測定pH值、酒精度、糖度。

1.3.3 香氣成分分析

火龍果酒香氣成分萃?。簻?zhǔn)確量取50 mL酒樣，倒入分液漏斗中，用20 mL二氯甲烷分別萃取3次，每次搖動(dòng)5 min，待靜置分層后分離出下層二氯甲烷相，將3次萃取后的二氯甲烷合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至 1 mL，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析。氣相色譜條件：毛細(xì)管柱VF-WaX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度230℃；載氣為氦氣；流速 1 mL/min；進(jìn)樣量 2 μL；不分流；柱溫程序：60℃保持2 min，以10℃/min升至150℃保持2 min，再以8℃/min升至210℃保持20 min。質(zhì)譜條件：電子碰撞源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；掃描范圍m/z 40～450。

采用Xcalibur2.0版本軟件及NST2008譜圖庫進(jìn)行火龍果酒香氣成分的檢索鑒定，兼顧保留時(shí)間進(jìn)行鑒定，采用內(nèi)標(biāo)法（2-辛醇）進(jìn)行各組分定量。

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

參考劉文麗等[13]的方法，挑選6名訓(xùn)練有素的食品專業(yè)人員作為評(píng)定人員，其中3女3男，年齡在20歲～30歲之間，試驗(yàn)在常州大學(xué)中澳果酒實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)品酒室完成，試驗(yàn)重復(fù)3次。所有感官評(píng)價(jià)采用定量描述分析法（quantitative descriptive analysis，QDA），選取 10點(diǎn)制標(biāo)度：0～9（香氣：0=沒氣味，9=氣味最強(qiáng)；顏色：0=無顏色，9=顏色最深；味道：0=沒味道，9=味道最強(qiáng)）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Origin 2018作圖，SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan法差異分析，P＜0.05，差異顯著；對(duì)8種火龍果酒香氣成分的含量進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中糖度、酒精度和pH值變化

不同發(fā)酵體系中火龍果酒理化指標(biāo)見圖2。

圖2 不同菌種發(fā)酵體系中糖度、酒精度、pH值的變化Fig.2 Changes in total sugar content，ethanol content，and pH in different fermentation systems

從圖2可以看出，不同菌種及其混合發(fā)酵方式下發(fā)酵液的糖度變化趨勢相同，發(fā)酵前期糖度下降速率快，后期下降平緩，直至發(fā)酵結(jié)束糖度基本不變。非釀酒酵母PRELUDE和NS-D對(duì)糖的利用率低于釀酒酵母，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)糖度仍保持較高的水平，混合發(fā)酵對(duì)糖的利用率接近單菌釀酒酵母發(fā)酵。

糖是酒精發(fā)酵的基質(zhì)，酵母通過呼吸作用將糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖己推渌碑a(chǎn)物，不同發(fā)酵體系的酒精變化與其糖度變化是相應(yīng)的。由圖2可知，釀酒酵母發(fā)酵的酒精度高達(dá)11.7%vol，而德爾布有孢圓酵母由于只能利用發(fā)酵液中的葡萄糖、果糖和蔗糖，不能分解麥芽糖、麥芽三糖，因而產(chǎn)酒精能力較弱[14]，PRELUDE和NS-D酒精度分別為9.8%vol和8.3%vol。混合發(fā)酵中的酒精度相較于非釀酒酵母得到明顯提升，這與對(duì)糖的利用結(jié)果一致。將非釀酒酵母對(duì)酒品質(zhì)的提升能力與釀酒酵母的高效發(fā)酵結(jié)合起來，有利于釀造出高酒精度的高品質(zhì)果酒。

發(fā)酵液的酸堿度是影響酵母發(fā)酵活力的重要因素之一，發(fā)酵液的pH值變化對(duì)酵母活動(dòng)有一定的影響。由圖2可知，不同菌種發(fā)酵體系中pH值的變化趨勢相同，但分解酸的能力不同。由于乙醛脫氫酶的轉(zhuǎn)錄在釀酒酵母中高表達(dá)、在德爾布有孢圓酵母中低表達(dá)，且乙酰輔酶a合成酶與乙酰輔酶a水解酶的轉(zhuǎn)錄在德爾布有孢圓酵母中高表達(dá)、在釀酒酵母中低表達(dá)，因而德爾布有孢圓酵母分解乙酸的能力高于釀酒酵母[15]，導(dǎo)致德爾布有孢圓酵母的發(fā)酵液pH值高于釀酒酵母。由圖2可知，混合發(fā)酵液pH值比單菌釀酒酵母發(fā)酵液高，說明混合發(fā)酵可以在生物維度上調(diào)節(jié)果酒酸度，對(duì)果酒風(fēng)味的形成有積極的影響。

2.2 不同發(fā)酵體系中香味物質(zhì)比較

不同發(fā)酵體系中主要香氣成分見表1。

表1 不同發(fā)酵體系中主要香氣成分Table 1 Aroma compounds identified in pitaya wines from different fermentations

由表1可得，8種不同發(fā)酵體系酒樣中共檢測出24種主要香氣成分，其中酯類物質(zhì)9種，酸類物質(zhì)8種，醇類物質(zhì)6種，酮類物質(zhì)1種。

乙酸被認(rèn)為是影響果酒風(fēng)味的重要影響因素之一，超過0.7 g/L時(shí)會(huì)散發(fā)出刺鼻的酸味，給果酒帶來不良口感[16-17]。在單菌發(fā)酵中RB2和X16產(chǎn)生的酸類化合物較多，其中乙酸含量最高達(dá)到8.12 mg/L，在PRELUDE和NS-D的單菌發(fā)酵中乙酸含量明顯降低，在混合發(fā)酵中乙酸含量均低于RB2與X16的發(fā)酵液，說明德爾布有孢圓酵母可以降低乙酸的產(chǎn)生[18-19]。苯乙醇可以賦予果酒良好的花香與果香味，乳酸乙酯和葵酸乙酯具有果香和奶油香氣[20]，在PRELUDE和NSD的單菌發(fā)酵液均檢測到高濃度的苯乙醇、乳酸乙酯和葵酸乙酯，說明德爾布有孢圓酵母能夠調(diào)節(jié)果酒香氣[21]。異戊醇是在火龍果酒中產(chǎn)生的較多的高級(jí)醇[22]，可以提供酒香，增加火龍果酒香氣的復(fù)雜度。

在混合發(fā)酵體系中，酯類物質(zhì)種類與含量較釀酒酵母單菌發(fā)酵明顯增加，在CF1中乳酸乙酯、琥珀酸乙酯與月桂酸乙酯含量升高，在CF3中葵酸乙酯含量增加，酯類化合物具有良好的香味，有助于提高火龍果酒的感官特性。3-甲基-1-戊醇因其具有蘑菇和土壤的特殊氣味常被用于調(diào)味劑和芳香劑，在有PRELUDE和NS-D參與的酒樣中均檢測到相當(dāng)含量的3-甲基-1-戊醇，表明德爾布有孢圓酵母具有很好地調(diào)節(jié)果酒香氣的潛力[23-24]。

2.3 火龍果酒風(fēng)味成分主成分分析（principal component analysis，PCA）

主成分特征值及其貢獻(xiàn)率見表2。

表2 主成分特征值及其貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

由表2可知，第一主成分貢獻(xiàn)率為71.388%，第二主成分貢獻(xiàn)率為10.468%，2個(gè)成分累計(jì)貢獻(xiàn)率超過80%，因此2個(gè)主成分可以有效解釋變量信息。

不同發(fā)酵體系中風(fēng)味物質(zhì)主成分分析圖見圖3。

圖3 不同發(fā)酵體系中風(fēng)味物質(zhì)主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis score and loading plots of the aroma compounds produced from different fermentations

由圖3a可知，1，3-丁二醇、乳酸、棕櫚酸乙酯等與PC1呈顯著正相關(guān)，琥珀酸乙酯、月桂酸乙酯等與PC1呈顯著負(fù)相關(guān)。PC2與3-甲基-1-戊醇、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯等呈顯著正相關(guān)，與乙酸乙酯、苯乙醇、乙酸等呈顯著負(fù)相關(guān)。

由圖3b可知，8種發(fā)酵火龍果酒分別位于不同的4個(gè)象限，可以反映出8種發(fā)酵體系的火龍果酒的風(fēng)味具有較大的差異。RB2與X16在PCA1上得分較高，說明1，3-丁二醇、乳酸、棕櫚酸乙酯在RB2與X16中含量較高，PRELUDE與CF1在PCA2上得分較高，說明3-甲基-1-戊醇、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯在其中含量較高。PRELUDE與CF1得分接近，兩者風(fēng)味接近，NSD與CF4得分接近，說明NS-D對(duì)CF4的風(fēng)味形成有調(diào)整作用，RB2與CF3得分接近，X16與CF2得分接近，說明其風(fēng)味相近。PRELUDE與NS-D位于PC1的負(fù)極，RB2與X16位于PC1的正極，而混合發(fā)酵主要集中在PC1的中間位置，說明混合發(fā)酵對(duì)果酒的風(fēng)味物質(zhì)有很大的調(diào)整作用[25-27]。

2.4 不同發(fā)酵體系中火龍果酒的感官評(píng)價(jià)

通過對(duì)不同發(fā)酵體系中火龍果酒的感官評(píng)價(jià)，得出火龍果酒的主要風(fēng)味特征為果香、花香、甜香、生青味、發(fā)酵香、酸味、甜味、紅色、醇香，并對(duì)各描述特征強(qiáng)度取平均值，如表3所示，并形成風(fēng)味剖面圖，見圖4。

表3 不同火龍果酒的各項(xiàng)感官屬性得分Table 3 Average scores of pitaya wines from sensory analyses

圖4 不同發(fā)酵體系中火龍果酒的感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.4 Radar plots depicting the favor profles of pitaya wines produced by different fermentation

就香氣屬性而言，花香、果香、醇香是火龍果酒的主要香氣特征，在果香和花香上PRELUD、NS-D與CF1得分較高，RB2與X16得分較低。RB2、X16與CF1醇香濃烈豐滿，CF3與CF4醇香寡淡單薄。生青味對(duì)火龍果酒香氣貢獻(xiàn)較小，發(fā)酵香在各火龍果酒中差異不大。就味道屬性而言，由于PRELUDE與NS-D對(duì)糖分利用不足且產(chǎn)酸低，造成它們?cè)诳谖渡掀?，且酸味不足，酒體單薄，口感單調(diào)，在混合發(fā)酵CF1～CF4中，酒體圓潤、豐滿，酸甜適中，爽口。就色澤屬性而言，除CF4外，其他7種火龍果酒色澤紅艷，紅色調(diào)突出，外觀良好。綜上所述，CF1混合發(fā)酵火龍果酒香氣馥郁協(xié)調(diào)，酒體醇厚圓潤，口感酸爽，色澤紅艷，屬于高品質(zhì)火龍果酒。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)兩種非釀酒酵母與釀酒酵母的單菌發(fā)酵及混合發(fā)酵的發(fā)酵特性與風(fēng)味進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母PRELUDE與NS-D雖對(duì)糖源利用不足，酒精發(fā)酵能力低，但結(jié)合釀酒酵母RB2與X16后酒精度可接近釀酒酵母。PRELUDE與NS-D都有很好地降低乙酸的能力，產(chǎn)苯乙醇、乳酸乙酯和葵酸乙酯的能力高，且可以產(chǎn)出具有異域風(fēng)味的3-甲基-1-戊醇，混合發(fā)酵可以在生物維度上調(diào)節(jié)火龍果酒的酸度，同時(shí)提高酒體中酯類物質(zhì)的種類與含量，能夠賦予火龍果酒良好的風(fēng)味特征與香氣屬性。在感官評(píng)價(jià)中混合發(fā)酵CF1花香和果香濃郁，酸甜爽口，顏色紅艷明亮，表現(xiàn)出更佳的感官品質(zhì)。以上結(jié)果說明德爾布有孢圓酵母PRELUDE與RB2混合發(fā)酵有利于釀造出香氣豐富、口感醇厚的高品質(zhì)火龍果酒。