姜多糖的提取、結(jié)構(gòu)表征和生物活性研究進(jìn)展

景永帥，程文境，張鈺煒，張瑞娟，張丹參，鄭玉光，吳蘭芳*

（1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北石家莊050200）

姜（Zingiber officinale Rosc.），又名白姜、均姜，是一種常用的藥食兩用資源，其根莖、葉均可入藥，在我國資源豐富、栽種歷史悠久。姜在中醫(yī)臨床應(yīng)用中有生姜、干姜、炮姜等。其中，生姜是姜的新鮮根莖，早在梁代，陶弘景在《名醫(yī)別錄》便將生姜作為單獨(dú)的一味藥物，具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳的功效，又可作烹調(diào)配料或制成醬菜、糖姜等；將生姜切片曬干或烘干后即得干姜，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其具有溫中散寒，回陽通脈等功效[1]；干姜經(jīng)砂燙法制得的炮制加工品即為炮姜，最早記載于東漢《傷寒論》，具有溫經(jīng)止血、溫和止痛等功效[2]。

姜含有多種活性成分，如多糖、多酚、萜類、姜辣素及其衍生物等[3]，其中，姜多糖作為姜的有效成分之一，受到了研究人員的廣泛關(guān)注。研究姜多糖的提取是對其深入研究及開發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)，探究其最佳提取工藝，能夠提高姜多糖的得率，進(jìn)而降低成本，增加利用率。姜多糖的生物活性一般都依賴于其結(jié)構(gòu)特征，多糖的單糖組成、糖苷鍵類型、空間構(gòu)型等都是影響其活性的因素，對姜多糖結(jié)構(gòu)的研究是其作為新型生物活性產(chǎn)品應(yīng)用的先決條件。因此，該文對近幾年國內(nèi)外關(guān)于姜多糖提取工藝、結(jié)構(gòu)特征以及藥理活性等方面進(jìn)行綜述，以期能為提高姜及其多糖的有效利用以及深入研究姜多糖結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系提供依據(jù)。

1 提取工藝

多糖是一類生物大分子，近幾年來，科研工作者們對多糖的提取技術(shù)進(jìn)行了系列的研究與探索，在傳統(tǒng)溶劑提取法的基礎(chǔ)上，建立了多種多糖的提取技術(shù)，如熱水提取法（hot water extraction，HWE）、超聲輔助提取法（ultrasonic assisted extraction，UAE）、微波輔助提取法（microwave assisted extraction，MAE）、酶輔助提取法（enzyme assisted extraction，EAE）等。除了上述提取方法外，還可以采用超高壓提取法（ultra-high pressure extraction，UHPE）、超聲細(xì)胞研磨提取法（ultrasonic cell grinder extraction，UCGE）、聯(lián)合提取法等方法來提取多糖物質(zhì)。姜多糖各提取法工藝優(yōu)化參數(shù)見表1。

表1 姜多糖各提取法工藝優(yōu)化參數(shù)Table 1 Optimization of extraction process parameters of ginger polysaccharide

Liao等[14]利用UCGE法提取生姜多糖，與HWE、EAE法相比，UCGE的多糖提取率最高，為（18.06±0.05）%。Chen等[11]分別應(yīng)用熱水浸提、堿溶液提取法提取生姜莖 葉 多 糖 （ginger stems and leaves polysaccharides，GSLPs），對比后發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用堿性溶液對其提取后所得多糖的提取率最高、生物活性最好。由此可知，可以通過改變?nèi)軇┑念愋蛠硖岣叨嗵堑奶崛÷?。Chen等[15]經(jīng)UAE提取的姜渣多糖（ginger pomace polysaccharides，GPPs）的抗氧化活性均優(yōu)于經(jīng)HWE提取的GPPs。即UAE在提高多糖的提取率的同時，保證了GPPs擁有較高的抗氧化活性。

2 姜多糖的分離純化

姜粗多糖中常含有蛋白質(zhì)、色素及部分小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在會影響后續(xù)的結(jié)構(gòu)分析和機(jī)制研究。姜多糖常用的除色素方法有活性炭吸附法、過氧化氫法、離子交換樹脂法及大孔吸附樹脂法等[16]。常用的除色素方法有Sevag法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等[17]。對于無機(jī)鹽、單糖和寡糖等小分子物質(zhì)，可以采用透析、超濾等方法除去[11]。秦衛(wèi)東等[18]考察了三氯乙酸法、鞣酸法和Sevag法對生姜多糖的蛋白脫除效果，結(jié)果表明鞣酸法的效果較好，脫除蛋白后的生姜多糖純度為73%左右。

多糖進(jìn)一步純化的方法主要有大孔樹脂柱層析法、離子交換層析法和凝膠柱層析法等[19]。在姜多糖的分離純化過程中，若想達(dá)到樣品的純度要求，通常需要結(jié)合2種～3種分級純化方法。表2總結(jié)了不同分離純化方法的原理及其在姜多糖中的應(yīng)用情況。

表2 多糖分級的方法及其在姜多糖中的應(yīng)用Table 2 Classification of polysaccharides and its application in ginger polysaccharides

綜上所述，DEAE-52纖維素離子交換柱、Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱、Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱等為姜多糖常用的分離純化手段。

3 姜多糖的結(jié)構(gòu)分析

多糖的一級結(jié)構(gòu)主要包括單糖組成、連接方式、排列順序及單糖間糖苷鍵類型等。原料和提取方法的不同，所得多糖的測定結(jié)果也會有所不同，這些參數(shù)均與多糖的生物活性和功能性質(zhì)密切相關(guān)。因此，多糖的結(jié)構(gòu)分析是多糖研究的基本內(nèi)容和主要難題之一，因此，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和表征具有重要的作用。

根據(jù)已知報道的姜多糖的相關(guān)研究方法，整理總結(jié)了姜多糖的提取純化與結(jié)構(gòu)表征流程，見圖1。

圖1 姜多糖的提取純化與結(jié)構(gòu)表征流程圖Fig.1 Flow chart of extraction，purification and structure characterization of ginger polysaccharide

3.1 姜多糖的分子量

多糖的生物活性與分子量有關(guān)，因此對姜多糖的分子量及其分布進(jìn)行研究是十分必要的。姜多糖的分子量測定方法有高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）、凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）。表3為不同研究者對姜多糖的分子量的測定結(jié)果。

表3 姜多糖的分子量測定Table 3 Determination of molecular weight of ginger polysaccharide

已有研究表明，小分子量的多糖的抗腫瘤活性較強(qiáng)[22]。Sun等[23]對比了不同分子量多糖的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)分子量最小的多糖組分具有較好的抗腫瘤作用，其分子量為6.53 kDa。Liao等[14]研究表明，姜多糖的分子質(zhì)量分布范圍較廣，分布在11.81 kDa～1 831.75 kDa之間。

3.2 姜多糖的單糖組成

通常采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、高效毛細(xì)管電泳法（high performance capillary electrophoresis，HPCE）、薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）等對姜多糖的單糖組成進(jìn)行分析。表4為姜多糖的組分名稱、單糖組成及摩爾比和鑒別方法。

表4 姜多糖的單糖組成及表征方法Table 4 Monosaccharide composition and characterization of ginger polysaccharide

經(jīng)對比后發(fā)現(xiàn)不同來源的姜多糖的單糖組成具有一致性，主要是由 Glc、Rha、Man、Gal、Ara 等按照不同比例組成，Chen等[11]試驗(yàn)結(jié)果表明，姜多糖中還存在少量的GlcA及GalA。

3.3 姜多糖的糖苷鍵連接方式

目前，通常采用化學(xué)分析與儀器分析聯(lián)用的方法來測定多糖糖苷鍵連接方式。甲基化法是最常用的化學(xué)分析方法。儀器分析法包括核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、紅外吸收光譜法（fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）等。Liao等[14]采用 HWE、EAE、UCGE 這 3 種方法提取生姜多糖，經(jīng)DEAE-52纖維素陰離子交換柱、Sephadex G-200凝膠柱分離純化后得到5種多糖組分，F(xiàn)T-IR測定結(jié)果表明，這5種多糖組分均為α型-吡喃糖；13C-NMR，1H-NMR測定UGP1主要以β-（1→6）-D-Galp聚合而成，UGP2主要以 α-（1→3）-LArap 聚合而成，EGP2主要以 β-（1→6）-D-Galp聚合而成，對比后發(fā)現(xiàn)，這5種多糖組分的結(jié)構(gòu)具有相似性，由此可以預(yù)測姜多糖的大致結(jié)構(gòu)為α-（1→4）-DGlpc及 α-（1→4）-D-Manp；經(jīng)抗腫瘤活性分析后發(fā)現(xiàn)具有β-（1→6）-D-Galp的多糖具有較好的抗腫瘤活性[14]。具體糖苷鍵連接方式及表征方法如表5所示。

表5 姜多糖的糖苷鍵連接方式及表征方法Table 5 Glycosidic linkage and characterization of ginger polysaccharide

4 生物活性

姜多糖是姜中的有效成分之一，因其具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、止咳、抗疲勞等多種生物活性，成為了近年來的研究熱點(diǎn)，并廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)保健及制藥工業(yè)中。

4.1 抗腫瘤活性

近年來，天然多糖因其優(yōu)異的抗腫瘤活性和相對低的毒性以及對正常細(xì)胞無明顯的副作用而受到研究者的廣泛關(guān)注。Cheng等[26]研究了鮮姜、干姜和蒸姜對人的Hela癌細(xì)胞的抗增殖作用的影響。結(jié)果表明，蒸姜在120℃、4 h時的抗Hela癌細(xì)胞增殖作用分別比干姜和鮮姜高出了1.5倍和2倍。Sun等[23]經(jīng)提取分離純化后獲得了不同分子量的多糖，發(fā)現(xiàn)低分子量多糖具有較好的抗腫瘤作用。Liao等[14]經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)提取的生姜多糖（UGP1和UGP2），與其它3種純化多糖相比，UGP1和UGP2對H1975、B16和MCF-7型腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用沒有較大差別，但在相同劑量下，相對分子質(zhì)量較小且具有β-（1→6）-D-Galp結(jié)構(gòu)的UGP1對HCT116型腫瘤細(xì)胞的抑制率較高，具有較好的抗腫瘤活性。Wang等[25]運(yùn)用MTT法、細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞核形態(tài)觀察、活性氧觀察等方法測定生姜多糖的抗腫瘤活性，結(jié)果顯示，生姜多糖（neutral ginger polysaccharide fraction，NGP）對 HepG2 細(xì)胞活性有明顯的抑制作用，當(dāng)其濃度為0.4 mg/mL時，對HepG2細(xì)胞的抑制率高達(dá)49.63%，并且發(fā)現(xiàn)GP是通過下調(diào) Bcl-2mRNA 表達(dá)，上調(diào) Bax、Fas、Fasl、p21、p53、caspase-3 mRNA表達(dá)來誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗肝癌活性。Yang等[27]發(fā)現(xiàn)生姜多糖對體外培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞有顯著的免疫活性，對巨噬細(xì)胞的增殖、免疫物質(zhì)（NO、TNF-α、IL-1β 和 IL-6）的產(chǎn)生起到了明顯的促進(jìn)作用；在NGP的濃度為200 μg/mL時，NO、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的分泌量分別為29.41 μmol/L、1 496.71、44.30、1 889.83 pg/mL，因此NGP可能成為一種潛在的免疫劑，為進(jìn)一步的鏈構(gòu)象和免疫機(jī)制研究提供了有意義的信息。

4.2 抗氧化活性

多糖的抗氧化活性受多種綜合因素的影響，如糖醛酸含量、分子量、單糖組成、硫酸化程度、糖苷鍵類型等。目前已有報道表明，糖醛酸含量高、分子量小的多糖通常具有更顯著的抗氧化活性[28]。Chen等[11]采用自由基清除活性法測定了4種姜多糖樣品體外抗ABTS+自由基、DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力，以及亞鐵離子的螯合活性和還原能力，結(jié)果表明，ASE-GSLP的抗氧化能力最強(qiáng)，分子量最小，糖醛酸含量最高，為6.266%。Zhang等[29]以生姜多糖為研究對象，采用不同體外培養(yǎng)體系對其抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)3種樣品均具有一定的抗氧化活性，其中G2的分子量較低、糖醛酸含量（7.45%）較高。夏宇[30]發(fā)現(xiàn)生姜皮多糖GE1、GE2、GE3具有一定的抗氧化活性，并隨其濃度的增加而加強(qiáng)，其中GE2的抗氧化能力最強(qiáng)，分子量（194 kDa）最小。

4.3 降血糖作用

多糖可通過促進(jìn)胰島素分泌、改善胰島素抵抗及調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性這3種途徑來降低血糖。Chen等[11]將提取的GSLPs作為口服降糖藥物應(yīng)用于高血糖患者，并測試其作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HWE、UAE、ASE、EAE這4種方式提取的GSLP對α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈劑量依賴性，IC50值由小到大排序如下：ASE-GSLP＜EAE-GSLP＜UAE-GSLP＜HWE-GSLP，由此可知，ASE-GSLP和HWE-GSLP對α-葡萄糖苷酶分別表現(xiàn)出最強(qiáng)和最弱的抑制作用，這可能與它們的糖醛酸含量有關(guān)，糖醛酸含量高的對α-葡萄糖苷酶的抑制活性較強(qiáng)。雖然作為抑制能力最強(qiáng)的多糖組分，ASE-GSLP的抑制能力仍低于阿卡波糖，但這些特性仍然可表明GSLPs具有作為有效的糖尿病抑制劑的潛力。此外，α-葡萄糖苷酶抑制活性歸因于多糖中存在游離羧基和羥基，它們可與消化酶的氨基酸殘基相互作用導(dǎo)致酶失活[28]；并且?guī)л^多電荷的多糖更容易與α-葡萄糖苷酶形成絡(luò)合物，更容易限制酶的活性[31]。因此，ASE-GSLP對α-葡萄糖苷酶抑制活性最高可能是由于其分子量較小，糖醛酸、硫酸鹽含量較高，并且結(jié)構(gòu)中還存在游離羧基和羥基。

4.4 鎮(zhèn)咳作用

已有研究表明天然來源的多糖具有鎮(zhèn)咳作用[32-34]。Bera等[35]報道了姜多糖（water extracted polysaccharides，WEP）的鎮(zhèn)咳作用，以豚鼠為實(shí)驗(yàn)對象，用胸腺譜儀測定了WEP的鎮(zhèn)咳活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WEP能顯著抑制實(shí)驗(yàn)性誘發(fā)的豚鼠咳嗽反射，沒有明顯改變氣道平滑肌的收縮功能，誘導(dǎo)止咳活性而不上癮，這與臨床常用的止咳藥磷酸可待因相近，且未出現(xiàn)顯著的毒性或副作用；對其結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，WEP主要是由葡聚糖和少量GalA構(gòu)成，因此推測葡聚糖也有一定的鎮(zhèn)咳作用。

4.5 其它活性

除了以上生物活性以外，姜多糖還具有抗疲勞[12]、保護(hù)腦缺血損傷[36]等生物活性，還可用做血栓的抗凝劑和治療試劑[37]。

5 構(gòu)效關(guān)系分析

對姜多糖結(jié)構(gòu)的解析顯示，發(fā)現(xiàn)其分子量分布在5.277 kDa～1 981.265 kDa 之間，主要由 Glc、Rha、Man、Gal、Ara等按照不同比例組成，具有吡喃糖構(gòu)型，并還可能含有少量的GlcA及GalA；其中，分子量、糖苷鍵類型及糖醛酸含量等對姜多糖的生物活性影響較大，通常分子量小、糖醛酸含量較高的姜多糖具有較強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤、降血糖及鎮(zhèn)咳活性。Sun等[23]對比了不同分子量姜多糖的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)分子量最小的姜多糖組分（6.53 kDa）具有較好的抗腫瘤作用，另有研究表明，存在 β-（1→6）-D-Galp 或三螺旋結(jié)構(gòu)[25，38]的姜多糖組分的抗腫瘤活性較強(qiáng)。

6 討論與總結(jié)

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對姜多糖的提取工藝、分離純化、結(jié)構(gòu)和藥理作用機(jī)制的研究越來越廣泛，因此本文對姜多糖的提取方法、結(jié)構(gòu)及其生物活性進(jìn)行總結(jié)。綜上可以看出姜多糖最常用的提取方法是熱水回流提取法，在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用輔助手段如超聲提取、微波提取、酶提取來改進(jìn)提取工藝，有效提高了姜多糖的提取效率。姜多糖在疾病預(yù)防及保健品開發(fā)等方面有廣闊的應(yīng)用前景，具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖和鎮(zhèn)咳等多種生物活性，對這些活性作用產(chǎn)生影響的因素可能是其分子量、糖醛酸含量、糖苷鍵的連接方式等。但目前，姜多糖的提取純化手段仍不成熟，對其高級結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制研究較少、生物活性研究多停留在體外及動物實(shí)驗(yàn)等；今后，應(yīng)對姜多糖的提取工藝優(yōu)化及與其成分含量變化等進(jìn)行系統(tǒng)研究，形成更加標(biāo)準(zhǔn)、可控的制備工藝；借助現(xiàn)代分析技術(shù)對姜多糖結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系進(jìn)行深入研究，明確其物質(zhì)基礎(chǔ)及構(gòu)效關(guān)系；利用轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白質(zhì)組定量和修飾分析等前沿技術(shù)闡釋姜多糖生物活性的分子機(jī)理，比如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老和鎮(zhèn)咳作用相關(guān)的基因表達(dá)和信號調(diào)控途徑，為姜多糖更好的在食品、保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。