準噶爾山楂果實內(nèi)生真菌的分離、鑒定及抗菌代謝物質(zhì)研究

吳昊，劉偉，劉琳玉，任艷利

（伊犁師范大學生物與地理科學學院，新疆伊寧835000）

植物內(nèi)生菌是指一種在植物部分或全部生活史中存活于健康植物各種組織的內(nèi)部或細胞的間隙，但卻不能使宿主植物產(chǎn)生病理特征的微生物[1]。研究表明內(nèi)生菌在植物體內(nèi)廣泛存在且能通過與宿主植物的相互作用產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物[2]。代謝產(chǎn)物具有促進植物生長、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[3-4]。槲皮素和山奈酚均是黃酮類化合物的典型代表，這兩個化合物均有一定的抑菌效果。滕楠[5]驗證了槲皮素對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等均有較強的抑制效果。徐海瑛等[6]利用從魚腥草中提取出的槲皮素與槲皮素金屬配合物對比研究抑菌效果，結(jié)果表明，槲皮素單體和槲皮素-Zn的抗菌活性均較強。金黃色葡萄球菌能夠形成被膜從而抵御某些不利因素的干擾，明迪[7]發(fā)現(xiàn)山奈酚能從多種途徑抑制金黃色葡萄球菌被膜的形成，從而間接起到抑菌作用。柏曉輝等[8]采用組織塊法從黃精根部分離出的內(nèi)生菌及其發(fā)酵液對綠膿桿菌和蘇云金芽孢桿菌均有較強的抑菌效果。楊夢莉等[9]從燈盞花的根、莖、葉和花中分離出7株產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌，根部的內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮的濃度達到2.625 mg/L。鄧振山等[10]從酸棗的莖分離出了可以產(chǎn)生黃酮的內(nèi)生真菌，并有很強的抑菌活性。張婷等[11]從油茶中分離出2株具有產(chǎn)黃酮能力的內(nèi)生真菌，并測得發(fā)酵液中的黃酮含量分別為0.011 3 mg/mL和0.013 5 mg/mL。

目前尚未有關(guān)準噶爾山楂果實內(nèi)生真菌的分離鑒定的報道，本研究對準噶爾山楂果實中內(nèi)生真菌進行分離和鑒定，檢測它們的抑菌活性，篩選出有抑菌活性的菌株，并對它們的發(fā)酵液進行分析檢測，分析抑菌效果，以期為準噶爾山楂果實的綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

準噶爾山楂：于2017年10月在霍城縣大西溝鄉(xiāng)采集供試材料，經(jīng)伊犁師范大學焦子偉教授鑒定為薔薇科準噶爾山楂的果實，洗凈后于4℃冰箱保存。槲皮素標準品、山奈酚標準品：上海源葉生物科技有限公司；dNTPs、PCR緩沖液、快速DNA提取試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；通用引物ITS1、ITS4：上海生工生物工程有限公司；乙腈（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余試劑均為分析純。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）：伊犁師范大學微生物實驗室提供。

ACQUITY UPLC H-Class高效液相色譜儀[配備光電二極管矩陣檢測器]：沃特世科技（上海）有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：瑞士步奇公司；TGL-18M高速冷凍離心機：美國米爾洛克公司；T-100PCR儀：美國伯樂公司。

1.2 準噶爾山楂果實內(nèi)生真菌的分離、純化和保存

將采集的準噶爾山楂果實表面洗凈，晾干水分。無菌水沖洗3次，用75%乙醇漂洗（20 s～30 s）后無菌水沖洗3次，8%次氯酸鈉溶液浸泡5 min后無菌水沖洗4次，用無菌濾紙片吸干表面上的水分，切成5 mm×5 mm×1 mm大小的組織塊接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potapo dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)5 d～10 d[12]。每日觀察材料，待組織塊邊緣有菌絲長出，采用尖端菌絲挑取法把真菌轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過2次～3次純化，得到純化菌株，對已純化的菌株編號，轉(zhuǎn)至凍存管PDA培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d～7 d，然后放入-20℃的冰箱內(nèi)保存。

1.3 方法

1.3.1 試驗菌種的活化和菌懸液制備

從冰箱中取出培養(yǎng)3代的內(nèi)生真菌，置于無菌操作臺上，使用5 mm的打孔器挑取菌餅接種到PDA平板中央，置于25℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5 d～7 d后備用。

金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的活化及菌懸液的配制：用接種環(huán)各挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的單菌落接種于滅菌的LB斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)挑取適量已活化的細菌，分別接入含有LB液體培養(yǎng)基的無菌錐形瓶（50 mL）中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h，即得金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌懸液。

1.3.2 抑菌試驗

瓊脂塊法：取已配制好的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌懸液150 μL，用三角玻璃棒涂布均勻（9 mm培養(yǎng)皿）。在每個LB固體培養(yǎng)基上用5 mm打孔器打均勻分布的3個孔，然后用直徑為5 mm的打孔器取果實內(nèi)生真菌菌餅，放入LB固體培養(yǎng)基中。將其放入37℃培養(yǎng)箱，倒置，恒溫培養(yǎng)12 h，以十字交叉法測量菌落直徑。

濾紙片法：在每個涂布細菌菌液的培養(yǎng)皿中均勻放置3個濾紙片。同時，蒸餾水作為陰性對照組，常用的氨芐青霉素濾紙作為陽性對照。37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，計算其平均值[13]。

1.3.3 抑菌活性物質(zhì)的檢測

取1.3.2檢測出的有抑菌活性的內(nèi)生真菌，用直徑5 mm的打孔器，沿菌落邊緣打菌餅，取3顆～4顆菌餅放入100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，在25℃、180 r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)7 d～10 d，即為種子發(fā)酵液。每100 mL PDA液體培養(yǎng)基中加入1 mL種子發(fā)酵液，在25℃、180 r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)，直到發(fā)酵液顏色變得澄清，菌絲球大小、密度穩(wěn)定。在抽濾瓶中放一層脫脂棉，兩層濾紙，對發(fā)酵液進行抽濾。然后，將抽濾好的發(fā)酵液在10 000 r/min的條件下離心10 min，除去菌絲和孢子[14-16]。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，用甲醇溶解后再經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾，制成供試樣品。

1.3.3.1 薄層色譜分析

取適量槲皮素和山奈酚標準品溶于甲醇制成標準品溶液。吸取適量樣品溶液、標準品溶液，在同一薄層板上點樣。以氯仿與甲醇（6∶1，體積比）為展開劑，上行展開10 cm，晾干，噴3%三氯化鋁-乙醇溶液，紫外燈下檢測（254 nm），比較樣品斑點的位置和標準品斑點的位置，進而初步篩選出能產(chǎn)槲皮素和山奈酚的內(nèi)生真菌[17]。

1.3.3.2 高效液相色譜分析

色譜條件：C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），以水+0.1%甲酸（A）-甲醇（B）為流動相，梯度洗脫（0～7 min，35%～52%B；7 min～8 min，52%～100%B；8 min～9 min，100%～35%B），進樣量 1.0 μL，檢測波長 360 nm，柱溫為30℃，流速0.3 mL/min[18]。準確稱取干燥的槲皮素和山奈酚標準品，用甲醇配成 1、2、3、4、5、6 mg/L 濃度梯度的標準品溶液。分別準確吸取1.3.3中處理好的樣品溶液和配制好的標準品溶液各1.0 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。以標準品濃度（mg/L）為橫坐標，以峰面積為縱坐標求回歸方程，根據(jù)回歸方程計算發(fā)酵液中槲皮素和山奈酚濃度。

1.4 產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定

采用點植培養(yǎng)法[19-20]進行鑒定。用接種環(huán)挑取少量菌絲點植在平板中央，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d～10 d。觀察菌落形狀、顏色、大小、培養(yǎng)基顏色、菌落邊緣形狀等。在25℃條件下，采用插片培養(yǎng)法進行菌種培養(yǎng)，待菌絲鋪展開，長過插片的位置后，在光學顯微鏡下觀察記錄菌絲和孢子的形態(tài)特征。依據(jù)真菌的形態(tài)學分類法，初步確定產(chǎn)黃酮菌株的種屬地位。

1.4.2 分子生物學鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法[21]提取真菌基因組 DNA，用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCGGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）5.8S rDNA-ITS進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增[22]。采用 50 μL 反應(yīng)體系：引物各2 μL，模板 1 μL，Taq 酶 1 μL，加雙蒸水至 50 μL。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 2 min，30個循環(huán)；72℃延伸 8 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收目標片段，送至上海生工生物工程公司測序。通過NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序在線比對分析，利用MEGA7.0軟件進行聚類分析，通過Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抑菌效果的內(nèi)生真菌的分離和篩選

2.1.1 抑菌試驗

從準噶爾山楂的果實中通過真菌分離培養(yǎng)共分離得到14株內(nèi)生真菌。按照SZ-A、SZ-B、SZ-C等英文字母順序進行命名，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌SZ-C及其發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用。

SZ-C及其發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果見圖1。

圖1 內(nèi)生真菌SZ-C及其發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of endophytic fungi SZ-C and itsfermentation broth on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

結(jié)果表明，培養(yǎng)12 h后，準噶爾山楂果實內(nèi)生真菌SZ-C對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在29 mm～39 mm之間，平均值34 mm（圖1A），對大腸桿菌也有明顯的抑菌活性，抑菌圈直徑在19 mm～20 mm之間，平均值19.3 mm（圖1B）。

通過濾紙片法對得到的內(nèi)生真菌的抑菌活性進行篩選。結(jié)果表明，培養(yǎng)12 h后，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在19 mm～21 mm之間，平均值20.3 mm（圖1C），對大腸桿菌也有明顯的抑菌活性，抑菌圈直徑在19 mm～21 mm之間，平均值19.7 mm（圖1D）。

2.1.2 抑菌活性產(chǎn)物的檢測

采用薄層色譜法檢測內(nèi)生真菌SZ-C的發(fā)酵液。在紫外燈下發(fā)現(xiàn)，供試品中出現(xiàn)了與槲皮素和山奈酚標準品顏色和比移值相同的熒光斑點，初步確定該菌株可能產(chǎn)槲皮素和山奈酚。

槲皮素、山奈酚標準品和SZ-C發(fā)酵液的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析見圖2。

圖2 槲皮素、山奈酚標準品和SZ-C發(fā)酵液的HPLC分析Fig.2 HPLC analysis of standard quercetin and phenol and fermentation liquor of SZ-C

高效液相色譜檢測顯示，槲皮素和山奈酚標準品分別在4.29 min和6.11 min出現(xiàn)峰值。內(nèi)生真菌SZ-C的發(fā)酵液與標準品在相同的時間出現(xiàn)了相同的吸收峰。結(jié)合薄層色譜法的結(jié)果，確定內(nèi)生真菌SZ-C的發(fā)酵液中含有槲皮素和山奈酚。

用移液器吸取不同濃度的標準品1 μL注入液相色譜儀，測定其峰面積。以濃度（mg/L）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，得到槲皮素的回歸方程為y=11 777x+10 480，R2=0.998 1；山奈酚的回歸方程為y=11 920x+9 813.3，R2=0.999 3。根據(jù)發(fā)酵液提取物的峰面積，由所得的回歸方程計算出發(fā)酵液中槲皮素和山奈酚的含量為1.253 mg/L和1.329 mg/L。

2.2 內(nèi)生真菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定

產(chǎn)槲皮素和山奈酚內(nèi)生真菌（SZ-C）的形態(tài)特征見圖3。

圖3 產(chǎn)槲皮素和山奈酚內(nèi)生真菌（SZ-C）的形態(tài)特征Fig.3 Morphology characteristics of quercetin and phenol endophytic fungi SZ-C

由圖3可知，菌絲生長較慢，生長初期為白色，后顏色逐漸變深，變?yōu)樯罹G色，菌落變厚，SZ-C向外圍顏色依次變淺，邊緣有明顯白色絨毛狀?；|(zhì)由淺黃色逐漸加深，變?yōu)樯詈稚?。在顯微鏡下可以觀察到菌絲貼培養(yǎng)基生長，暗綠色，呈樹枝狀，分支，分生孢子梗長，呈暗綠色，孢子形狀不一（短棒狀、橢球狀、球狀、卵圓狀）。

2.2.2 分子生物學鑒定

內(nèi)生真菌SZ-C 5.8S rDNA-ITS序列擴增片段的凝膠電泳分析見圖4。

圖4 內(nèi)生真菌SZ-C 5.8S rDNA-ITS序列擴增片段的凝膠電泳分析Fig.4 Agqrose electrophoresis analysis of the amplified fragment of the endogenous fungi SZ-C 5.8S rDNA-ITS sequence

利用真菌PCR擴增通用引物ITS1、ITS4對內(nèi)生真菌（SZ-C）基因組DNA進行序列擴增，分別得到相應(yīng)的單一DNA條帶，長度為540 bp，該片段包括ITS1、5.8S rDNA和ITS4的全部序列，以及18sDNA和28sDNA的部分序列。將測序序列提交至Gen Bank數(shù)據(jù)庫，獲得登陸號MH754635。利用Blast程序和Clustalx軟件，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知菌序列進行同源性序列比較分析，選擇與其同源性大于99.5%的菌種，利用MEGA7.0軟件進行聚類分析，通過Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5。

圖5 準噶爾山楂果實內(nèi)生真菌SZ-C的5.8S rDNA-ITS序列系統(tǒng)進化發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree of 5.8S RDNA-ITS sequence of endophytic fungus SZ-C from hawthorn fruit

結(jié)果表明，SZ-C與Alternaria tenuissima是同一個屬，結(jié)合形態(tài)學特征分析，將SZ-C確定為極細鏈格孢菌。

3 結(jié)論與討論

采用組織塊法從準噶爾山楂果肉中成功分離出14株內(nèi)生真菌，通過拮抗試驗測定篩選出具有抑菌作用的內(nèi)生真菌，結(jié)果表明，內(nèi)生真菌SZ-C對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的拮抗效果最為顯著，經(jīng)過培養(yǎng)特征、形態(tài)學鑒定5.8S rDNA-ITS基因序列分析和遺傳圖譜分析，確定SZ-C為極細鏈孢格菌。

發(fā)酵液抑菌試驗結(jié)果表明SZ-C的代謝產(chǎn)物具有較大的抑菌潛力，通過對發(fā)酵液的成分進行薄層層析和高效液相色譜分析得出發(fā)酵液中含有較高含量的槲皮素和山萘酚，其中槲皮素含量為1.253 mg/L，山萘酚含量為1.329 mg/L，結(jié)合文獻推測發(fā)酵液的抑菌效果可能與這兩個化合物有關(guān)，抑菌機制可能與破壞細菌細胞壁的完整性和細菌在培養(yǎng)基上的形態(tài)有關(guān)[23-24]；從對不同病原菌的抑制作用來看，不管是內(nèi)生真菌本身還是內(nèi)生真菌的發(fā)酵液，對金黃色葡萄球菌的抑制作用都較為顯著，在后續(xù)的研究中希望能夠以分離得到的高活性菌株的發(fā)酵產(chǎn)物為基礎(chǔ)，測定槲皮素和山奈酚的含量與抑菌效果的關(guān)系，研發(fā)出相關(guān)植物源抑菌劑。

植物內(nèi)生真菌資源豐富，其次生代謝產(chǎn)物種類繁多，是極具有開發(fā)應(yīng)用前景的微生物資源。在本研究分離出的14株內(nèi)生真菌中SZ-C的抑菌活性最為顯著，其發(fā)酵代謝產(chǎn)物中存在的槲皮素和山奈酚具有一定的抗菌能力，可通過多種方法從發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)其他抑菌活性物質(zhì)并進一步分離得到這些特殊的活性物質(zhì)，并證明發(fā)揮抑菌作用的是哪一類化合物，是否是新的天然產(chǎn)物，這將再次證明植物內(nèi)生菌的次級代謝產(chǎn)物具有廣闊的應(yīng)用前景。