巴西橡膠樹轉(zhuǎn)錄中介體HbMed25基因克隆與表達(dá)分析

張世鑫 吳紹華 楊署光 晁金泉 李招娣 田維敏

摘 要：轉(zhuǎn)錄中介體（mediator，Med）中的Med25基因在植物的組織發(fā)育、器官發(fā)生、脅迫響應(yīng)以及調(diào)控茉莉酸（JA）信號途徑等方面起重要調(diào)控作用。該文在巴西橡膠樹基因組序列中找到了橡膠樹Med25基因的序列，通過RT-qPCR和RACE技術(shù)克隆HbMed25基因的全長序列并進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測分析結(jié)果顯示，HbMed25基因包含2 655 bp的開放閱讀框，編碼884個氨基酸，蛋白分子量為95 kD，理論等電點為8.68，疏水性蛋白，亞細(xì)胞定位最可能為細(xì)胞核。Real-time PCR分析結(jié)果顯示，HbMed25基因在樹皮中表達(dá)量最高，在植物激素JA處理的形成層和膠乳材料中HbMed25基因在處理早期（1 h和2～4 h）上調(diào)表達(dá)，受割膠處理HbMed25基因在處理早期上調(diào)表達(dá)且對高產(chǎn)的橡膠樹品系（CATAS 8-79和CATAS 7-33-97）的割膠處理響應(yīng)更明顯。綜上結(jié)果認(rèn)為，HbMed25基因極大可能參與了JA信號途徑的調(diào)控，對闡明JA誘導(dǎo)橡膠樹次生乳管分化的分子調(diào)控機(jī)制具有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹，HbMed25，表達(dá)分析，茉莉酸信號途徑，乳管分化，橡膠合成

中圖分類號：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）09-1548-13

Abstract：The Med25 gene in the transcription mediator （Med）plays an important regulatory role in many processes，such as tissue development，organogenesis，stress response，and regulation of jasmonate acid（JA）signaling pathway in plants. The Med25 gene sequence was found in the genome of Hevea brasiliensis，and the full-length sequence of HbMed25 gene was cloned by RT-qPCR and RACE technology，and the biological information was predicted and analyzed. The results were as follows：The HbMed25 gene included an open reading frame for 2 655 bp，encoded 884 amino acids，the molecular weight was 95 kD and theoretical isoelectric point was 8.68，hydrophobic protein，and most likely localized in the nucleus in subcellular localization analysis. Real-time PCR analysis results showed that HbMed25 was the most highly expressed in the bark; HbMed25 was up-regulated at the early stage of treatment （1 h and 2-4 h）in the cambium and latex treated by the plant hormone of JA. After tapping，HbMed25 had the highest expression at the early stage of tapping treatment，and up-regulates expression in high-yield rubber clones（CATAS 8-79 and CATAS 7-33-97）. All the results indicate that HbMed25 is highly likely to participate in the regulation of the JA signal pathway，and it plays a role in promoting the molecular regulation mechanism of JA-induced secondary laticifer differentiation.

Key words：Hevea brasiliensis，HbMed25，expression analysis，jasmonate signaling pathway，laticifer differentiation，rubber synthesis

中介體復(fù)合物（mediator，Med）在植物不同組織發(fā)育、花期、花的結(jié)構(gòu)、植物抗逆性等方面具有重要作用。例如：Med8、Med17、Med18、Med20A可以調(diào)控植物的花期（Kim et al.，2011）;Med18、Med21參與植物響應(yīng)生物逆境脅迫（Dhawan et al.，2011）;Med16參與植物對非生物的逆境響應(yīng)（Wathugala et al.，2011）。在眾多的Med成員中，Med25的研究相對較多且對基因功能的了解更詳細(xì)。AtMed25可調(diào)控擬南芥中光敏色素信號的PFTI （Wollenberg et al.，2007; Backstrom et al.，2011），在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中具有顯著作用（Elfving et al.，2011）。AtMed25的缺失突變體植株細(xì)胞體積變大、細(xì)胞數(shù)目增加，導(dǎo)致植物的器官體積增大;過量表達(dá)AtMed25的植株細(xì)胞體積變小、細(xì)胞數(shù)目變少，導(dǎo)致植物器官體積減小。可見，AtMed25可以調(diào)控植物細(xì)胞的增殖速度和體積大小，是植物器官體積大小的負(fù)調(diào)控因子（Xu & Li，2011）。Chen et al.（2012）發(fā)現(xiàn)Med25與抗逆相關(guān)的茉莉酸（jasmonate acid，JA）信號途徑有密切聯(lián)系，AtMed25通過與AtMYC2直接相互作用使RNA聚合酶Ⅱ招募到AtMYC2 的靶標(biāo)啟動子區(qū)域來調(diào)控茉莉酸響應(yīng)基因表達(dá)，之后又發(fā)現(xiàn)Med25參與調(diào)控茉莉酸信號途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)COI1-JAZ-MYC2。在植物處于自然狀態(tài)下，Med25與JAZ蛋白是競爭關(guān)系，競爭結(jié)合MYC2的結(jié)合位點，Med25與MYC2間的相互作用相對較弱;Med25還與JA受體COI1直接發(fā)生相互作用，將COI1招募到茉莉酸途徑的核心轉(zhuǎn)錄因子MYC2的靶標(biāo)基因啟動子區(qū)域。植物發(fā)育或應(yīng)對逆境脅迫時，產(chǎn)生活性茉莉酸（JA-Ile），Med25促進(jìn)依賴于活性形式茉莉酸的“COI1-JAZ”受體復(fù)合物的形成，引起JAZ蛋白的降解，使Med25與MYC2的相互作用增強(qiáng)，MYC2由轉(zhuǎn)錄抑制轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄機(jī)器，激活茉莉酸下游的響應(yīng)基因的表達(dá)（Chen et al.，2012; Zhai & Li，2019; Wu et al.，2019）。

天然橡膠（natural rubber）是四種重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資之一，世界上99%的天然橡膠來自巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）（祁棟靈等，2012）。巴西橡膠樹的乳管是天然橡膠合成和貯存的地方，與天然橡膠產(chǎn)量直接相關(guān)的是樹干樹皮中的次生乳管（郝秉中和吳繼林，1982;Hao & Wu，2000）。乳管由維管形成層細(xì)胞分化而來，是一種特化的分泌組織。維管形成層細(xì)胞分化成次生乳管的過程，稱為次生乳管分化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)割膠、機(jī)械傷害和茉莉酸類物質(zhì)都可以誘導(dǎo)橡膠樹的次生乳管分化（Hao & Wu，2000;劉惠芳等，2001;Wu et al.，2002;Zhang et al.，2015;Tian et al.，2015），并建立了一套穩(wěn)定的體外誘導(dǎo)橡膠樹萌條次生乳管分化的實驗系統(tǒng)。我們前期還發(fā)現(xiàn)橡膠樹的乳管細(xì)胞中存在特定的茉莉酸信號通路HbCOI1-HbJAZ3-HbMYC2，其通過上調(diào)法尼基焦磷酸合酶（FPS）基因和小橡膠粒子蛋白（SRPP）基因的表達(dá)增強(qiáng)天然橡膠生物合成（Deng et al.，2018）。因此，我們提出調(diào)節(jié)橡膠樹次生乳管分化和橡膠生物合成的茉莉酸信號途徑可能是乳管細(xì)胞的一條主要信號途徑，并且推測植物中介體Med25在JA信號途徑中起重要的調(diào)控作用。

模式植物中Med25的研究較多，其功能被越來越多地揭示出來。然而，橡膠樹中Med25的研究相對滯后。本文克隆了巴西橡膠樹的Med25基因，通過Real-time PCR技術(shù)分析其在組織特異性、茉莉酸處理的形成層和膠乳樣品以及不同植物激素處理的膠乳樣品中的基因表達(dá)，為揭示Med25參與茉莉酸信號途徑調(diào)控橡膠樹次生乳管分化和橡膠生物合成的分子調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 HbMed25基因的克隆

HbMed25基因的開放閱讀框（ORF）信息來自巴西橡膠樹無性系CATAS 7-33-97基因組測序結(jié)果（Tang et al.，2016），得到的基因序列信息經(jīng)過Blast比對后，設(shè)計ORF引物擴(kuò)增出基因開放閱讀框并測序確認(rèn)。

引物序列HbMed25-OF為5′-ATGGCGGAGAAGCAGCTGGT-3′，HbMed25-OR為5′-TTAACTCATAAATCCACCTCCAGGC-3′。使用橡膠樹無性系CATAS 7-33-97的膠乳cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增HbMed25基因的全長cDNA。PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35 次;72 ℃延伸20 min;16 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化目的條帶，連接轉(zhuǎn)化到pEASY-Blunt Simple載體上，挑取陽性單克隆，使用M13引物進(jìn)行菌落PCR篩選，選取插入DNA片段正確的陽性單克隆，送到廣州天一測序公司進(jìn)行測序，以確定克隆基因cDNA序列的準(zhǔn)確性。

1.2 同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI ORF finder工具對獲得的HbMed25基因序列進(jìn)行ORF預(yù)測和確定，使用DNAMAN 7.0軟件將ORF序列翻譯為相應(yīng)的氨基酸序列，并進(jìn)行序列同源性比對;使用NCBI Conserved Domains工具和SMART工具獲取HbMed25蛋白的保守結(jié)構(gòu)域信息;使用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam、ProtScale 和TMpred Server等工具進(jìn)行HbMed25蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性以及跨膜結(jié)構(gòu)的推測;使用The predicted NLS進(jìn)行氨基酸序列的核定位信號的預(yù)測;使用SWISS-MODEL工具對HbMed25蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

通過JGI網(wǎng)站Phytozome工具檢索到來源于陸生植物和藻類的65個Med25的蛋白序列。本文將橡膠樹HbMed25蛋白序列和其他陸生植物和藻類的65個Med25的蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，使用MEGA 6軟件繪制Neighbor joining系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行1 000 bootstrap的統(tǒng)計學(xué)檢測。

1.3 組織特異性表達(dá)

所用材料為巴西橡膠樹無性系CATAS 7-33-97的開割成齡樹和一年生萌條，均種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊基地。同一時間采集同一棵橡膠樹的側(cè)根、幼莖、穩(wěn)定期葉片、雌花、種仁（外胚乳）、樹皮、萌條的形成層區(qū)和膠乳等樣品進(jìn)行組織特異性表達(dá)，每個樣品均來自3棵樹樣品的混合。采集膠乳樣品時，棄去前1 min流出的膠乳，取割膠后2～5 min流出的膠乳，膠乳直接在1.5 mL RNase free離心管中與裂解液SL（TIANGEN RNAprep Pure PlantKit，DP441）以膠乳與裂解液的體積比為1∶5進(jìn)行混合，置于冰上，立即提取總RNA 或-80 ℃保存?zhèn)溆?其他組織樣品采集后，液氮速凍，液氮研磨后提取總RNA 或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 割膠處理

一天時間中橡膠樹的韌皮部組織膨壓在凌晨時段最高，割膠后的排膠動力最大，隨后在一天中逐步降低，到了晚上逐步恢復(fù)（Buttery & Boatman，1966）。凌晨時環(huán)境溫度低，能夠降低黃色體破裂導(dǎo)致的膠乳凝集，增加排膠的時間（Shi et al.，2019）。此外，橡膠生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)還具有明顯的晝夜節(jié)律性（楊鵬等，2019）。為避免割膠時間、環(huán)境溫度和節(jié)律性等因素對本實驗的干擾，割膠組和對照組需在同一時間進(jìn)行割膠和采集膠乳。選取同一林段且割齡一致的巴西橡膠樹無性系CATAS 7-33-97的開割樹，分為割膠和對照兩組，割膠組的橡膠樹35株，在同一時間進(jìn)行割膠處理后，分別在割膠后的0.5、2、6、12、24、48、72 h等時間點進(jìn)行第二次割膠，采集第二次割膠的膠乳作為不同時間割膠處理的樣品。對照組的35株橡膠樹不進(jìn)行同一時間割膠處理，僅在割膠組第二次割膠時進(jìn)行割膠，采集的膠乳樣品作為不同時間割膠處理的對照。每個時間點的開割樹膠乳樣品來自5棵樹膠乳樣品的混合，并采集3個生物學(xué)重復(fù)。

1.5 植物激素等化學(xué)因子處理

用單面刀片刮去面積為2 cm × 4 cm的萌條莖表皮及部分皮層，用滅菌的脫脂棉包裹處理部位，分別施加含有4 500 μg·mL-1 6-BA（對照組為滅菌水）、50 000 μg·mL-1 GA（對照組為滅菌水）、5 000 μg·mL-1 ET（對照組為滅菌水）、0.032 μg·mL-1曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）（對照組為5% DMSO溶液）、6.39 μg·mL-1冠菌素（coronatine，COR）（對照組為滅菌水）的溶液，利用塑料封口膜包裹，分別處理1、2、8、24、48、72、120 h，拆去脫脂棉和塑料封口膜，收集處理部位的膠乳。每個時間點的膠乳樣品來自5根萌條的膠乳混合，并采集3個生物學(xué)重復(fù)。

按照同樣的方法，使用6.39 μg·mL-1 COR（對照組為滅菌水）的溶液處理，分別處理0.5、1、2、8、24、48、72 h，切取處理部位的萌條樹皮，通過冰凍切片和激光顯微切割的方法，分離形成層區(qū)樣品。每個時間點的形成層樣品來自15根萌條樣品的混合，并采集3個生物學(xué)重復(fù)。

1.6 Real-time PCR 分析

使用總量為1 μg的總RNA樣品，參照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （K1622）的說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板，稀釋10倍以后，進(jìn)行Real-time PCR分析。通過Bio-Rad CFX Manager 3.0的分析系統(tǒng)（Bio-Rad Labratories Inc，Ca，USA）進(jìn)行Real-time PCR分析，以巴西橡膠樹的肌動蛋白基因HbACTIN（Gene bank：JF270598）（Zhao et al.，2011）為內(nèi)參基因，分析HbMed25基因在橡膠樹各個組織和各種處理樣品中的相對表達(dá)量。

Real-time PCR的引物序列HbMed25-QF為5′-GCAGCACCATGATTCCAACTC-3′，HbMed25-QR為5′- AGCCGAAGCACTCCTGTAAC-3′。參照TransStart Tip Green qPCR SuperMix （AQ141-04）的使用說明配制Real-time PCR的反應(yīng)體系，使用Bio-rad CFX Manager 3.0配套的384孔板進(jìn)行Real-time PCR的反應(yīng)，每個反應(yīng)配制10 μL的反應(yīng)體系，成分如下：1 μL cDNA模板，0.6 μL的正向引物和反向引物，5 μL TransStart Tip Green qPCR SuperMix，用ddH2O補齊至10 μL。基因的相對表達(dá)量，使用Bio-Rad CFX Manager 3.0的分析系統(tǒng)自帶的 2-ΔΔCT 方法進(jìn)行統(tǒng)計。每個樣品進(jìn)行3次實驗技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbMed25基因的克隆和生物信息學(xué)分析

通過基因克隆及測序驗證，從巴西橡膠樹膠乳中擴(kuò)增獲得HbMed25基因的全長ORF-cDNA序列2 655 bp（圖1）。使用ExPASy ProtParam在線分析工具分析HbMed25推導(dǎo)氨基酸序列的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)HbMed25氨基酸數(shù)量為884（圖1），并存在Med25蛋白特有的MED25_VWA保守結(jié)構(gòu)域（圖2：A），相對分子量為95 kD，理論等電點8.68，HbMed25蛋白為偏堿性蛋白。HbMed25蛋白的脂肪系數(shù)為76.45，HbMed25蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為34.83，為穩(wěn)定蛋白。使用ExPASy-TMpred Server在線分析工具進(jìn)行HbMed25蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)HbMed25蛋白為親水性蛋白（圖2：B），HbMed25蛋白的總平均疏水指數(shù)均為-0.401，HbMed25蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)（圖2：C）。使用SignalP4.1 Server的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽，結(jié)果表明HbMed25蛋白可能不存在信號肽。使用WoLF PSORT在線分析工具預(yù)測HbMed25蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明HbMed25蛋白能夠定位到細(xì)胞核且得分較高。通過The predicted NLS工具進(jìn)行核定位信號預(yù)測，發(fā)現(xiàn)HbMed25含有較強(qiáng)的核定位信號，預(yù)測的核定位信號得分高達(dá)0.86分（分?jǐn)?shù)范圍為0～1），核定位信號序列為EKKLCA，如圖3的紅點所示。利用SWISS-MODEL全自動蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源性建模的方法，建立HbMed25的蛋白三級結(jié)構(gòu)，如圖2：D所示。

2.2 HbMed25基因的系統(tǒng)發(fā)育和同源性分析

將HbMed25推導(dǎo)的氨基酸序列，與其他模式植物的Med25基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示HbMed25蛋白序列與擬南芥AtMed25（AT1G25540.2）、木薯MeMed25 （LOC110600417）、蓖麻RcMed25（LOC8260402）和楊樹PtMed25 （PF11265）蛋白，如圖4的五角星所示的序列相似性分別為61.34%、87.01%、51.91%和73.63%，且均具有Med25_VWA結(jié)構(gòu)域（圖3）。HbMed25蛋白與不同種類植物Med25蛋白序列一致性較高，說明該基因在植物進(jìn)化過程中較保守。

使用MEGA 6軟件將橡膠樹HbMed25氨基酸序列和其他陸生植物和藻類的65個Med25的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，由圖4可知，65個Med25共分為6個組別（通過不同顏色區(qū)分），這些組別主要是按照植物的進(jìn)化程度進(jìn)行分類，如HbMed25與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、楊樹（Populus trichocarpa）、蓖麻（Ricinus communis）、木薯（Manihot esculenta）等高等植物聚類在一起，分在第1組（Group 1）中（分別用紅色和藍(lán)色五角星形標(biāo)示）;黃瓜（Cucumis sativus）和胡蘿卜（Daucus carota）兩種植物分在第2組（Group 2）;磯山耬斗菜（Aquilegia coerulea）單獨在第3組（Group 3）;二穗短柄草（Brachypodium distachyon）和團(tuán)藻（Volvox carteri）等12種植物單分在第4組（Group 4）;紫萍（Spirodela polyrhiza）單獨分在第5組（Group 5）;鳳梨（Ananas comosus）和卷柏（Selaginella moellendorffii）等8種植物分在第6組（Group 6）。

2.3 HbMed25基因的組織特異性表達(dá)

對橡膠樹無性系CATAS 7-33-97的側(cè)根、幼莖、葉片、雌花、 種仁、開割樹樹皮、 開割樹膠乳以及一年生萌條的形成層和初生膠乳等不同組織樣品中的HbMed25基因表達(dá)進(jìn)行Real-time PCR分析，結(jié)果表明HbMed25基因在開割樹皮中表達(dá)豐度最高，在側(cè)根、雌花、開割膠乳中表達(dá)豐度較高，在幼莖、葉片和胚乳中表達(dá)豐度較低（圖5：A）。

在自然狀態(tài)下的橡膠樹一年生萌條的形成層和初生膠乳樣品中的HbMed25基因表達(dá)豐度較低，差異不大（圖5：B）。

2.4 割膠對HbMed25基因表達(dá)的影響

對橡膠樹無性系CATAS 7-33-97的未開割樹和開割成齡樹的膠乳進(jìn)行比較，分析割膠對HbMed25基因表達(dá)的影響。通過Real-time PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HbMed25基因割膠處理的膠乳中的表達(dá)量比未開割樹的雖高一些，但沒有達(dá)到顯著差異（圖6：A）。

為進(jìn)一步驗證割膠對HbMed25基因的影響，通過統(tǒng)一時間割膠后，在不同時間內(nèi)第二次割膠，收集第二次割膠的膠乳來研究橡膠樹的膠乳生物合成，以消除割膠過程中機(jī)械傷害對膠乳生物合成過程中的影響。Real-time PCR結(jié)果表明，割膠處理的膠乳中HbMed25基因受割膠處理上調(diào)表達(dá)，割膠后2 h顯著上調(diào)表達(dá)，在6 h時達(dá)最大值，在12 h時雖有所恢復(fù)，但仍有極顯著的上調(diào)表達(dá)，直到24 h時才逐漸恢復(fù)至對照水平，整個割膠過程中對HbMed25的基因表達(dá)模式呈正向拋物線型（圖6：B）。

為進(jìn)一步了解割膠在橡膠樹不同品系中HbMed25基因表達(dá)的變化，本文對橡膠樹PPIM 600、PR 107、CATAS 7-33-97和CATAS 8-79等4個品系的未開割樹進(jìn)行割膠處理，每72 h割1刀，共割5刀（第0、第1、第2、第3和第4刀），采集不同刀次的膠乳，分析割膠在橡膠樹不同品系中HbMed25基因表達(dá)的變化。Real-time PCR結(jié)果表明，除RRIM 600在第0刀的表達(dá)量最高，隨后幾刀的表達(dá)量都低于第0刀，整體呈現(xiàn)下調(diào)模式以外，在PR 107、CATAS 7-33-97和CATAS 8-79等3個品系的膠乳中，割膠處理的膠乳中HbMed25基因均表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)的趨勢，且大致在第1刀的表達(dá)量最高，呈現(xiàn)上調(diào)后下調(diào)的正向拋物線型變化（圖6：C-F）。

2.5 茉莉酸對HbMed25基因表達(dá)的影響

利用茉莉酸活性形式結(jié)構(gòu)的類似物—冠菌素（COR）體外誘導(dǎo)橡膠樹萌條次生乳管分化實驗系統(tǒng)，使用COR處理橡膠樹無性系CATAS 7-33-97的一年生萌條并采集處理部位的形成層區(qū)樣品和初生膠乳樣品。Real-time PCR結(jié)果表明，HbMed25基因在COR處理后的形成層區(qū)和初生膠乳樣品中均上調(diào)表達(dá)。根據(jù)基因在形成層區(qū)和膠乳中的表達(dá)豐度、上調(diào)表達(dá)的時間點、上調(diào)表達(dá)持續(xù)時間和上調(diào)表達(dá)倍數(shù)幾個指標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)以下一些規(guī)律。在形成層區(qū)和初生膠乳中的表達(dá)豐度比較，HbMed25基因在形成層區(qū)中的表達(dá)豐度低于初生膠乳（圖7）。HbMed25基因在COR處理的形成層樣品中主要在早期時間段（1～4 h）有顯著的上調(diào)表達(dá)，且在形成層材料中在1 h達(dá)最高峰值，約為對照水平的5倍，呈正向拋物線型變化（圖7：A）;在COR處理的初生膠乳中HbMed25在各時間段持續(xù)高水平的上調(diào)表達(dá)，且在2 h和4 h達(dá)最高峰值，為對照水平的10～20倍，也呈現(xiàn)正向拋物線型變化，說明COR處理可以明顯上調(diào)HbMed25基因在橡膠樹中的表達(dá)（圖7：B）。

2.6 植物激素對HbMed25基因表達(dá)的影響

使用COR體外誘導(dǎo)巴西橡膠樹萌條次生乳管分化類似的實驗系統(tǒng)分析乙烯（ET）、赤霉素（GA）、生長素（IAA）、細(xì)胞分裂素（6-BA）等植物激素處理的初生膠乳樣品中HbMed25的基因表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果表明，ET處理的初生膠乳樣品中，HbMed25基因最開始是下調(diào)表達(dá)，在2～8 h有明顯的上調(diào)表達(dá)，且在8 h達(dá)最高峰值，隨后又下調(diào)表達(dá)（圖8：A）。IAA處理的初生膠乳中，HbMed25基因處于下調(diào)模式，在1、8、72 h都是極顯著的下調(diào)表達(dá)，表達(dá)模式相對比較混亂，沒有明顯的規(guī)律（圖8：B）。在GA和6-BA處理的初生膠乳中，HbMed25基因的表達(dá)模式大致相似，在整個處理時間段內(nèi)都是處于下調(diào)表達(dá)，且在最早期（1 h）和中期（8～72 h）都是顯著或極顯著的下調(diào)表達(dá)（圖8：C，D）。

根據(jù)基因在初生膠乳中的表達(dá)豐度、表達(dá)的時間點、上調(diào)表達(dá)持續(xù)時間和上調(diào)表達(dá)倍數(shù)幾個指標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)以下的一些表達(dá)規(guī)律。在四種植物激素處理初生膠乳中的表達(dá)豐度與COR處理相比較要低很多，與未處理的未開割樹和開割樹膠乳的豐度差不多;與HbMed25基因在COR處理的初生膠乳樣品中整體的顯著上調(diào)表達(dá)且呈正向拋物線型變化，在其他四種植物激素處理的初生膠乳中，除ET處理的初生膠乳中在前期（2～8 h）有明顯上調(diào)表達(dá)外，其他植物激素處理都是下調(diào)表達(dá)，表達(dá)模式相反;與COR處理的初生膠乳中HbMed25在2 h和4 h達(dá)最高峰值，為對照水平的10～20倍，其他植物激素處理的初生膠乳中，僅ET處理的前期（2～8 h）雖有上調(diào)表達(dá)，但也未達(dá)到對照水平的2倍?？梢?，其他四種植物激素處理對HbMed25基因表達(dá)沒有直接作用。

3 討論與結(jié)論

本文克隆得到巴西橡膠樹HbMed25基因，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)橡膠樹HbMed25與木薯、楊樹等高等植物的Med25相似性較高，可能編碼親水性蛋白，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，這些信息與中介體復(fù)合物作用于RNA聚合酶Ⅱ的功能是吻合的。通過組織特異性表達(dá)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HbMed25在橡膠樹的樹皮、側(cè)根和雌花中的表達(dá)豐度較高，與擬南芥（Elfving et al.，2011）、紅掌（任保蘭等，2019）的組織特異性研究的結(jié)果類似。這些結(jié)果是與Med25在根中可以調(diào)節(jié)活性氧分布、生長素的濃度、細(xì)胞壁基因表達(dá)等，以及調(diào)控根毛的發(fā)育過程（Xu & Li，2011）;在花中可以調(diào)節(jié)花期、花的生成和花器官發(fā)育（Wollenerg et al.，2011）;并調(diào)節(jié)獼猴桃的花期和果實的大?。ü鬂?，2014）等方面發(fā)揮特殊功能是密切相關(guān)的。

天然橡膠是在巴西橡膠樹樹干樹皮韌皮部中的特化組織——次生乳管中合成的（Hao & Wu，2000），這些次生乳管的數(shù)量與天然橡膠的產(chǎn)量密切相關(guān)，是由維管形成層的紡錘狀原始細(xì)胞分化而來（Hao & Wu，2000）。我們前期研究的證據(jù)表明，茉莉酸（JA）（Hao & Wu，2000;劉惠芳等，2001）、機(jī)械傷害（Wu et al.，2002;Tian et al.，2015）和茉莉酸活性形式的類似物——冠菌素（COR）都可以誘導(dǎo)橡膠樹次生乳管分化，而且COR誘導(dǎo)橡膠樹乳管分化的效果比茉莉酸和茉莉酸甲酯（MeJA）要更強(qiáng)（Zhang et al.，2015）。在COR處理形成層區(qū)中，HbMed25在處理的早期表現(xiàn)出極顯著的上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)模式與茉莉酸處理的樹皮中JAZ成員、MYC成員的相似（Zhao et al.，2011; Deng et al.，2018）。在模式植物擬南芥的JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，MYC2是茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控JA反應(yīng)的多個方面，包括根生長發(fā)育、機(jī)械損傷反應(yīng)、抗病抗蟲等逆境脅迫反應(yīng)（Kim et al.，2011; Dhawan et al.，2011;Wathugala et al.，2011）。最近研究證明，AtMed25通過與AtMYC2直接相互作用，使RNA聚合酶Ⅱ招募到AtMYC2的靶標(biāo)啟動子區(qū)域來調(diào)控茉莉酸響應(yīng)基因表達(dá)（Chen et al.，2012; Zhai & Li，2019; Wu et al.，2019）。后來又發(fā)現(xiàn)，Med25參與調(diào)解茉莉酸信號途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)COI1-JAZ-MYC2，在植物處于自然狀態(tài)下，體內(nèi)沒有活性形式的茉莉酸（JA-Ile）時，JA受體COI1與抑制子蛋白JAZ不能發(fā)生互作，JAZ蛋白相對穩(wěn)定，并與MYC2相互作用以抑制MYC2的轉(zhuǎn)錄活性。在此過程中，JAZ蛋白與Med25處于競爭關(guān)系，競爭結(jié)合MYC2的結(jié)合位點，此時的Med25與MYC2間的相互作用相對較弱;此外，Med25還可以與JA受體COI1直接發(fā)生相互作用，將COI1招募到JA的核心轉(zhuǎn)錄因子MYC2的靶標(biāo)基因啟動子區(qū)域。可見，轉(zhuǎn)錄中介體Med25在茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要調(diào)控作用。據(jù)此推測Med25在JA橡膠樹次生乳管分化的進(jìn)程中也起重要的調(diào)控作用，而HbMed25在COR處理的早期就表現(xiàn)出極顯著的上調(diào)表達(dá)，可以印證HbMed25參與了橡膠樹體內(nèi)的JA信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控。

外施MeJA上調(diào)橡膠合成相關(guān)基因及增強(qiáng)橡膠合成的作用是相似的（Deng et al.，2018），并能夠增加橡膠產(chǎn)量（楊署光等，2019）。乙烯利作為最有效的排膠刺激劑，能顯著延長排膠時間，增加膠乳產(chǎn)量（史敏晶等，2015），但與橡膠生物合成沒有直接關(guān)系（Deng et al.，2018）。割膠和JA促進(jìn)橡膠樹次生乳管分化和膠乳再生（郝秉中和吳繼林，1982），割膠可以引起兩方面的反應(yīng)，即機(jī)械傷害反應(yīng)和排膠導(dǎo)致膨壓的變化。機(jī)械傷害會誘導(dǎo)乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因ACS的表達(dá)，合成大量內(nèi)源乙烯（Argueso et al.，2007），機(jī)械傷害和膨壓的變化會產(chǎn)生內(nèi)源JA（Howe & Schilmiler，2002）。目前，割膠引起膠乳產(chǎn)量增加是ET還是JA導(dǎo)致的還不甚明了。ET是一種強(qiáng)刺激劑，ET處理會引起諸多反應(yīng)，如ET促進(jìn)HEVB7、44KD蛋白等膠乳凝集因子的增加，排膠時間延長（Shi et al.，2016）;ET提高水通道蛋白基因HbPIP的表達(dá)，增強(qiáng)水分向乳管細(xì)胞的運輸，增加膠乳的水稀釋效應(yīng)，增加膠乳產(chǎn)量等（An et al.，2015）。HbMed25是轉(zhuǎn)錄中介體基因，可以在組織發(fā)育、器官形成、植物抗逆性等方面起重要調(diào)控作用，HbMed25很有可能參與膠乳凝集反應(yīng)、水分調(diào)節(jié)等進(jìn)程，但目前尚無相關(guān)研究驗證。

從本文的HbMed25基因表達(dá)的模式發(fā)現(xiàn)，HbMed25在割膠處理膠乳中上調(diào)表達(dá)，且在產(chǎn)量相對較高的橡膠樹品系（CATAS 8-79和CATAS 7-33-97）的膠乳中也呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)模式，因此可以看出割膠是促進(jìn)HbMed25表達(dá)的。在JA活性形式結(jié)構(gòu)類似物——COR處理的初生膠乳中，HbMed25在早期就表現(xiàn)出極顯著的上調(diào)表達(dá)模式，與茉莉酸處理的膠乳樣品中HbCOI1和HbJAZ1成員上調(diào)表達(dá)模式相似（Deng et al.，2018; Howe et al.，2019），而在ET處理的膠乳中HbMed25基因基本處于下調(diào)表達(dá)。從基因表達(dá)的豐度方面分析，HbMed25在割膠、COR處理膠乳中的表達(dá)豐度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ET處理。最近，我們發(fā)現(xiàn)割膠樹的乳管細(xì)胞茉莉酸含量顯著高于未開割樹，割膠促進(jìn)天然橡膠生物合成與激活乳管細(xì)胞中的茉莉酸信號途徑密切相關(guān)（Deng et al.，2018;楊署光等，2019）。因此，我們推測割膠促進(jìn)橡膠生物合成的效應(yīng)大部分來自于機(jī)械傷害誘導(dǎo)的內(nèi)源JA的功效，而非內(nèi)源ET的作用。

由此可見，HbMed25是極有可能參與了橡膠樹茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控橡膠樹的次生乳管分化和橡膠生物合成反應(yīng)。下一步，我們將對Med25與JA信號途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)成員COI1-JAZ-MYC2進(jìn)行蛋白互作分析，為闡明巴西橡膠樹次生乳管分化和橡膠生物合成的分子調(diào)控機(jī)制打下良好基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）