帝蘿花‘璀璨明珠’的植株高效再生

彭綠春 宋杰 李樹發(fā) 蔡艷飛 瞿素萍 田歌 李世峰

摘 要：為解決木本切花植物帝蘿花‘璀璨明珠繁殖效率低的問題，該文以帝蘿花‘璀璨明珠的幼嫩枝芽為外植體，研究了不同基本培養(yǎng)基對其長勢的影響、不同激素種類和濃度對其增殖和生根的效果，分析了其離體繁殖的生長特點，并建立了高效的帝蘿花‘璀璨明珠組培快繁技術(shù)體系。結(jié)果表明：帝蘿花‘璀璨明珠幼嫩枝芽的消毒方法為0.1%的升汞溶液浸泡12 min，污染率為21.5%;外植體在WPM+ZT 1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基上，側(cè)芽萌發(fā)率為73%;增殖的最佳培養(yǎng)基為MS + BA 0.4 mg·L-1 + NAA 0.05 mg·L-1，增殖系數(shù)為6.63，增殖方式為側(cè)芽增殖和植株基部叢生芽增殖; 生根的適宜培養(yǎng)基為MS + IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1，生根率為70%;生根瓶苗移栽于珍珠巖和細草炭（體積比為0.5∶1）的基質(zhì)中，光照強度為10 000～12 000 lx，空氣濕度為70%～80%下培養(yǎng)，60 d后成活率可達72%。該研究結(jié)果為帝蘿花組培種苗的商業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐，同時促進了該高檔木本切花的推廣和種植及產(chǎn)業(yè)化。

關鍵詞：帝蘿花‘璀璨明珠，木本切花，植株高效再生，組培快繁

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）09-1542-06

Abstract：In order to improve reproduction efficiency of woody cut-flower plant Telopea speciosissima ‘Braidwood Brilliant，we used young branches and shoots as explants to reveal the growth characteristics of T. speciosissima ‘Braidwood Brilliantin in vitro culture and to establish its efficiently regeneration system，by studying the influence of basic medium on plant growth，the effect of hormone type，concentration on proliferation and rooting. The results were as follows：Treating explants with the 0.1% HgCl2 for 12 min，the explants contaminate rate was 21.5%; The lateral buds germination rate of explants was 73% on medium WPM+ZT 1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1; The optimal multiplication medium was MS + BA 0.4 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1with 6.63 proliferation coefficient，and the proliferating shoots originating from axillary bud and basic adventitious bud; MS + IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1 was the suitable rooting medium，with 70% rooting rate; The rooting seedlings were transplanted in the substrates[perlite∶moss（v∶v）=0.5∶1] in the greenhouse with light intensity 10 000-12 000 lx，air humidity 70%-80%，and the survival rate of the seedlings was 72% 60 d later. The results provide technological support for commercial production of Telopea speciosissima tissue culture seedlings，and promoted the planting and industrialization of this famous woody cut-flower.

Key words：Telopea speciosissima ‘Braidwood Brilliant，woody cut-flower，plant efficient regeneration，tissue culture speed propagation

帝蘿花（Telopea speciosissima）是山龍眼科（Proteaceae）帝蘿花屬（Telopea）多年生名貴木本觀賞植物，原產(chǎn)于澳大利亞和非洲熱帶地區(qū)，其花形獨特、花色艷麗、花期較長，既可用作切花，又可應用于園林美化。雖然早在2001年，我國廣州和云南等地就開始進行帝蘿花等山龍眼科木本花卉的資源引進和適應性研究（蹇洪英等，2006;蘇開君等，2008），但由于繁殖效率低，因此導致其產(chǎn)品主要依靠進口，在市場上仍然還是“一枝獨秀”。

山龍眼科植物的種子種殼堅硬且具有休眠特性，發(fā)芽率低且不整齊（Wu & Toit，2010）。其扦插繁殖生根率低，所需時間長（黎霞等，2009）。在南非、澳大利亞等原產(chǎn)地，依靠豐富的母本資源，帝蘿花主要通過扦插繁殖（Maclennan，1993），同時也有組織培養(yǎng)的相關研究。早在1989年，Wrigley & Fagg（1989）指出帝蘿花種苗的組培生產(chǎn)之所以沒有商業(yè)應用，是因為其組織培養(yǎng)難度太大。近年來，國內(nèi)外對山龍眼科植物組織培養(yǎng)的研究仍然較少。Wu et al.（2007）進行帝王花合子胚和子葉培養(yǎng)，認為植物激素抑制體細胞胚的形成，在無植物激素的培養(yǎng)基上誘導出胚狀體，并進行紅、藍光源影響其器官發(fā)生方式的研究（Wu & Dutoit，2012）。國內(nèi)僅報道過何麗娜等（2012）以莖段為材料進行帝王花啟動培養(yǎng)研究，而關于帝王花后續(xù)繁殖和生根等方面的研究國內(nèi)外沒有進一步報道。Offord et al.（1992）對11個帝蘿花優(yōu)株進行了組織培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)不同基因型間組織培養(yǎng)的效果不同，并指出帝蘿花組織培養(yǎng)成功的關鍵在于針對不同基因型進行生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的優(yōu)化。因此，對于目前還無組培繁殖研究報道的帝蘿花‘璀璨明珠，有必要進行植株高效再生的研究，以實現(xiàn)其組培種苗商業(yè)化生產(chǎn)。

帝蘿花‘璀璨明珠（Telopea speciosissima ‘Braidwood Brilliant）在21世紀初被引種到昆明，花紅色、鮮艷，適應性強，切花產(chǎn)量高，具有市場開發(fā)潛力（圖版I：A）。本研究以帝蘿花‘璀璨明珠幼嫩枝芽為外植體，通過不同基本培養(yǎng)基對其長勢的影響，不同激素種類和濃度對其增殖和生根的效果，以及瓶苗移栽馴化等關鍵環(huán)節(jié)的研究，揭示帝蘿花‘璀璨明珠離體繁殖的生長特點，建立高效的植株再生體系，為其組培種苗的商業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐，從而促進高檔木本切花——帝蘿花‘璀璨明珠的推廣、種植和產(chǎn)業(yè)化，同時為帝蘿花屬其他種的離體繁殖提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為帝蘿花‘璀璨明珠（以下簡稱‘璀璨明珠）幼嫩枝芽，采自云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所資源圃。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒和誘導培養(yǎng) 選取‘璀璨明珠幼嫩枝條，去除葉片、保留葉柄，用洗衣粉水清洗表面污垢后，剪成長度約為2 cm的莖段，每個莖段具2個葉柄，流水沖洗20 min。先用0.1%的升汞溶液浸泡12 min，再用無菌水沖洗5遍。將已消毒莖段在超凈工作臺上晾干表面水分后，接種至外植體誘導培養(yǎng)基WPM+ZT 1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。

1.2.2 基本培養(yǎng)基對‘璀璨明珠長勢的影響 將‘璀璨明珠的增殖苗切分成單棵，接種在以WPM、1/2MS、MS為基本培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基均附加 ZT 0.5 mg·L-1和NAA 0.05 mg·L-1。每種基本培養(yǎng)基處理設置3個重復，每個重復接種10個芽苗。60 d后觀察芽苗的長勢，并測定SPAD值和株高（表1）。

1.2.3 激素種類和濃度對‘璀璨明珠增殖的效果 將‘璀璨明珠叢芽分棵切開，接種到不同增殖培養(yǎng)基，試驗不同濃度ZT或6-BA組合0.05 mg·L-1的NAA對其增殖效果，激素組合見表2。根據(jù)1.2.2的試驗結(jié)果選擇基本培養(yǎng)基，每個激素濃度處理設3個重復，每個重復接種10個芽苗。60 d后統(tǒng)計其增殖系數(shù)及叢生芽高度等指標。

1.2.4 生根培養(yǎng)和瓶苗移栽 增殖培養(yǎng)60 d后，將株高2 cm左右的增殖苗分棵切開，接種到不同的生根培養(yǎng)基。根據(jù)1.2.2的試驗結(jié)果選定基本培養(yǎng)基，并附加不同濃度的IBA、NAA和活性炭組合（表3）。每個生根處理設3個重復，每個重復接種15株，之后觀察生根情況，40 d后統(tǒng)計生根率、株高和愈傷組織橫徑。

將生根苗帶瓶移至大棚內(nèi)，上方蓋遮陽網(wǎng)，光照強度為10 000～12 000 lx，煉苗1周后，移栽至育苗盒，栽培基質(zhì)配比為珍珠巖和細草炭（0～5 mm）體積比為0.5∶1。

1.2.5 培養(yǎng)條件 瓶苗培養(yǎng)條件為溫度（23±2）℃、光照12 h·d-1，光照強度3 000 lx。培養(yǎng)基附加瓊脂9 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、pH5.8。

穴盤苗培養(yǎng)條件：剛移栽時，光照強度為8 000～10 000 lx，空氣濕度為70%～80%，土壤只需保持表面潮濕即可，大約20 d發(fā)出新根后，可逐漸增大光照強度使之適應外部環(huán)境。

1.2.6 指標測定 SPAD值用SPAD-502型葉綠素計測定。選擇每一增殖叢芽中最高一株，測量其植株中部最大一片葉片的SPAD值作為該叢芽的SPAD值，測量一重復中所有叢芽的SPAD值，并取其平均值作為該重復的SPAD值。

株高、叢生芽高度和愈傷組織橫徑用直尺測量。從培養(yǎng)基表面到生根植株頂部的距離為株高，從培養(yǎng)基表面到叢生芽頂部的距離為叢生芽高度，植株基部愈傷組織的最大直徑為其橫徑，測量重復中每株的株高、叢生芽高度或橫徑，取其平均值作為該重復的株高、叢生芽高度或橫徑。

增殖系數(shù)為每一重復中長度大于2 cm的增殖芽數(shù)量與初始接種芽數(shù)的比值。

生根率為每一重復中生根的植株數(shù)與初始接種芽數(shù)的百分比。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 所得數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進行分析，采用鄧肯法在0.05水平上進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對‘璀璨明珠生長的影響

‘璀璨明珠莖干和枝葉表面光滑，采用1.2.1的方法進行外植體消毒和芽誘導，可達到較好效果，外植體污染率為21.5%，芽萌發(fā)率為73%，萌發(fā)的側(cè)芽葉形、葉色正常。將葉柄處萌發(fā)的側(cè)芽進一步轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基WPM+ZT1 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1后，隨著培養(yǎng)時間延長，植株首先從老葉開始失綠，然后變黃，最后整株變黃。

試驗不同基本培養(yǎng)基對‘璀璨明珠生長的影響，測定SPAD值和叢生芽高等指標統(tǒng)計如表1所示。芽苗接種到不同基本培養(yǎng)基后，隨著培養(yǎng)時間延長，植株長勢和葉色表現(xiàn)出差異，其中1/2MS和WPM培養(yǎng)基上的植株不同程度出現(xiàn)老葉失綠、變黃或葉色變淺的癥狀（圖版I：C，D），而MS培養(yǎng)基中植株生長健壯且葉色濃綠（圖版I：B）。SPAD值是一個反映植株葉綠素含量的指標，葉綠素的相對含量可以反映植株葉片的生理狀況。盧曉萍等（2013）的研究表明，SPAD值與單位葉面積葉綠素含量顯著相關。從表1可以看出，3種不同基本培養(yǎng)基處理下，SPAD值和叢生芽高2個指標均存在顯著差異，MS培養(yǎng)基中植株葉片的SPAD值和叢生芽高顯著高于其他2個處理，分別為32.57 cm和4.85 cm，指標差異趨勢與形態(tài)學表現(xiàn)一致，MS培養(yǎng)基更適合‘璀璨明珠生長。

2.2 不同細胞分裂素種類和濃度對‘璀璨明珠增殖的影響

‘璀璨明珠芽苗接種在MS基本培養(yǎng)基附加不同激素濃度組合的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)和叢生芽高均表現(xiàn)出差異。由表2可知，6-BA對‘璀璨明珠的增殖效果好于ZT，6-BA各處理下芽苗的增殖系數(shù)都高于ZT處理。其中，激素組合6-BA 0.4 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1處理下增殖系數(shù)達6.63（圖版I：B），顯著高于其他6個處理。6-BA處理下，隨著其濃度增加，可以觀察到瓶內(nèi)增殖的叢生芽和側(cè)芽增多，但當6-BA濃度達到0.8 mg·L-1時，統(tǒng)計的增殖系數(shù)反而有一定程度降低。從株高來看，無論是6-BA還是ZT處理，株高隨激素濃度增加而降低，且各濃度處理之間差異顯著。‘璀璨明珠離體芽苗的增殖方式主要為葉腋處側(cè)芽增殖和基部的叢生芽增殖（圖版I：E）。0.8～1.6 mg·L-1的6-BA處理下，芽苗基部增殖出大量飽滿的不定芽，但受高濃度6-BA影響，不定芽緊縮，不能伸長生長（圖版I：F），導致增殖出的有效苗數(shù)少，增殖系數(shù)低，整體株高低，從而影響后續(xù)植株的生根效率?？梢?，‘璀璨明珠離體芽苗增殖對6-BA敏感，一旦濃度稍高就可抑制其增殖和生長。

2.3 生根培養(yǎng)與煉苗移栽

MS基本培養(yǎng)基附加不同濃度NAA、IBA和2 000 mg·L-1活性炭組合處理，對‘璀璨明珠進行生根誘導。從3表可以看出，在相同NAA和IBA組合濃度下，‘璀璨明珠生根率、株高、愈傷組織橫徑3個指標，在是否添加活性炭的處理間存在顯著差異。各個添加活性炭的處理，生根率均為零，但株高和長勢卻顯著好于不添加的處理。這說明2 000 mg·L-1活性炭不利于‘璀璨明珠生根，但能促進其生長。從愈傷組織橫徑來看，除1號和2號處理之間無顯著差異外，其余在同一生長素濃度下，不添加活性炭處理的愈傷組織橫徑均顯著大于添加處理的?！裁髦橹挥性谝欢舛鹊纳L素誘導下才能生根，生根率隨生長素濃度增加而提高，且相同濃度IBA 0.8 mg·L-1和NAA 0.8 mg·L-1誘導的生根率無顯著差異。其中，IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1組合下生根率為70%，顯著高于其他處理（圖版I：G），株高較矮，為1.22 cm，而其愈傷組織橫徑較小，為0.54 cm，移栽時利于成活，故MS+ IBA 0.75 mg·L-1+ NAA 1 mg·L-1為‘璀璨明珠適宜的生根培養(yǎng)基。

將生根苗帶瓶移至大棚內(nèi)煉苗1周后，移栽至珍珠巖和細草炭（0～5 mm）體積比為0.5∶1的栽培基質(zhì)中。剛移栽時，光照強度為8 000～10 000 lx，空氣濕度為70%～80%，土壤只需保持表面潮濕即可，約20 d發(fā)出新根后，可逐漸增大光照強度使之適應外部環(huán)境。60 d后，穴盤苗株高為7～9 cm（圖版I：H，I），成活率為72%。

3 討論與結(jié)論

誘導培養(yǎng)階段，‘璀璨明珠外植體側(cè)芽的萌發(fā)率、側(cè)芽葉形和葉色正常，可滿足后續(xù)培養(yǎng)需求。在相同培養(yǎng)基中，進一步增殖培養(yǎng)會出現(xiàn)葉片失綠、變黃，到最后整株出現(xiàn)變黃的癥狀。分析原因主要是誘導階段，側(cè)芽萌發(fā)消耗外植體莖段和芽體自身的營養(yǎng)物質(zhì)，脫離母體進入增殖階段后，其生長需營養(yǎng)支持，在不適合的培養(yǎng)基上便出現(xiàn)生長異?，F(xiàn)象，說明本研究所用的誘導培養(yǎng)基還可進一步優(yōu)化。

MS是組織培養(yǎng)中應用較為廣泛的一種培養(yǎng)基，屬于富集元素平衡培養(yǎng)基;WPM培養(yǎng)基是木本植物組織培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基，屬于中鹽低氮培養(yǎng)基（吉訓志等，2019）?！裁髦樵鲋趁缭谥械囵B(yǎng)基1/2MS和低氮培養(yǎng)基WPM上長勢弱，且葉片不同程度黃化;測定SPAD值后，SPAD值低于MS培養(yǎng)基中增殖苗的。閆平等（2019）認為隨著施肥量的增加，2個超級稻品種葉片SPAD值呈逐步增加的趨勢。蔡艷飛等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在不同氮水平下，SPAD值及相對葉色差與單位干重的總氮含量具有顯著線性正相關關系，SPAD值的變化能夠反映60%的單位干重葉氮含量的變化，可以利用SPAD-502型葉綠素計對高山杜鵑進行快速、無損的氮素營養(yǎng)診斷。本研究中，不同氮素水平下，‘璀璨明珠增殖苗長勢和葉片SPAD值的變化趨勢與前人研究一致?！裁髦殡m然是木本植物，但其對基本培養(yǎng)基中的氮素和鹽分有一定需求。

活性炭是植物組織培養(yǎng)中生根環(huán)節(jié)常用的添加物，適于生根的濃度為0.1%～0.5%（孫占育等，2010）。韓文璞等（2001）在甜櫻桃組織培養(yǎng)中，在生根培養(yǎng)基中加入1 000 mg·L-1的活性炭，生根率達100%，根系發(fā)達、潔白，移栽成活率高。王獻革等（2003）在黃金梨的生根培養(yǎng)基中加入500 mg·L-1的生根效果好，生根率在80%以上。孫占育等（2010）認為，在植物生根的培養(yǎng)基中，加入一定濃度的活性炭有利于誘導生根，但如果活性炭濃度過高，則抑制其生根。本研究中，生根培養(yǎng)基添加2 000 m g·L-1活性炭處理，出現(xiàn)植株不生根而長勢健壯的情況。究其原因是活性炭濃度不合適而導致的不生根問題還是活性炭本身不適宜用于‘璀璨明珠生根，這還有待進行活性炭多濃度梯度對生根影響的研究。

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（責任編輯 蔣巧媛）