雞血血肽分離純化與抗氧化性研究

李新，汪蘭*，丁安子，吳文錦，孫靜，喬宇，石柳

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430064）

我國(guó)是家禽養(yǎng)殖、屠宰加工大國(guó)，近年來(lái)家禽養(yǎng)殖業(yè)呈規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展，成為我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中最活躍的增長(zhǎng)點(diǎn)和主要的支柱產(chǎn)業(yè)。家禽屠宰加工過(guò)程中產(chǎn)生大量的血液，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源，目前關(guān)于禽血精深加工與高值化利用研究較少。

氧化是人類(lèi)衰老與疾病主要誘因，脂質(zhì)與蛋白質(zhì)氧化均可以產(chǎn)生自由基，自由基的形成與累積會(huì)進(jìn)一步損傷生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞及組織的氧化損傷[1-2]?？寡趸瘎┛梢杂行б种谱杂苫难趸磻?yīng)，在減少細(xì)胞氧化、防止脂質(zhì)過(guò)氧化、降低自由基生成速率等方面具有重要作用[3]。檢測(cè)ABTS＋自由基、DPPH自由基、羥基自由基等自由基清除率是評(píng)價(jià)抗氧化活性常規(guī)方法[4-5]。通過(guò)酶解食源性蛋白質(zhì)獲得的多肽，可以具備與天然或合成類(lèi)抗氧化劑同樣甚至更好的抗氧化活性。國(guó)內(nèi)外研究表明，活性肽具備抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、螯合金屬離子、清除活性氧能力[6-7]?；钚噪目寡趸芰εc多肽的分子量、結(jié)構(gòu)和疏水性有著密切的關(guān)系[8-9]。本研究以雞血血紅蛋白為原料，采用中性蛋白酶水解，結(jié)合離心、濃縮、凍干等方法制備血肽，應(yīng)用葡聚糖凝膠色譜分離純化，收集并測(cè)定不同分子量范圍血肽體外抗氧化性，為實(shí)現(xiàn)禽血高值轉(zhuǎn)化利用提供技術(shù)支撐與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞血：市售。三氟乙酸、過(guò)硫酸鉀、ABTS、DPPH、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、乙醇、雙氧水、鄰苯三酚（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶（酶活≥100 U/mg，分析純）：合肥博美生物科技有限公司；乙晴、細(xì)胞色素C、抑肽酶、桿菌酶、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（色譜純）：北京安捷飛科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-25MS高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；L5S紫外分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；Waters1525高效液相色譜儀（配2487紫外檢測(cè)器和Empower工作站GPC軟件）：美國(guó)Waters公司；SIM FDS-2.5E真空冷凍干燥機(jī)：美國(guó)SIM公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

雞宰殺時(shí)收集雞血，添加0.2%乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，ED TA-2Na），攪拌均勻，置于冰盒中備用，離心處理（4000r/min，20 min），收集沉淀，凍干即為雞血血紅蛋白粉。以血紅蛋白粉為酶解底物，選用中性蛋白酶酶解，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定血肽酶解條件，即血紅蛋白底物濃度、酶添加量與酶解時(shí)間，研究分析血肽相對(duì)分子質(zhì)量分布、分離純化方法及其抗氧化性研究。

1.3.2 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

酶解液中的氨基酸態(tài)氮含量采用中性甲醛滴定法測(cè)定[10]。

1.3.3 總氮含量的測(cè)定

總氮含量采用半微量凱氏定氮法測(cè)定[11]。

1.3.4 水解度（degree of hydrolysis，DH）測(cè)定

水解度計(jì)算公式如下[12]。

DH/%=AN/TN×100

式中：AN為氨基酸態(tài)氮的含量，g/L；TN為總氮量，g/L。

1.3.5 血肽相對(duì)分子質(zhì)量分布檢測(cè)

1）樣品制備：稱取樣品10 mg于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后供進(jìn)樣。

2）色譜條件：色譜柱TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動(dòng)相為乙腈、水、三氟乙酸體積比 45∶55∶0.1；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；流速0.5 mL/min；柱溫30℃。

1.3.6 血肽分離純化試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[13-14]的方法，稱量SephadexG-154.5g，用蒸餾水加熱溶脹，脫氣，勻速倒入垂直放置的凝膠柱（16 mm×100 cm）中，置于4℃層析柜中。將柱的上端與恒流泵相連，0.5 mg/mL NaCl溶液洗脫12 h，使凝膠處于均勻緊實(shí)狀態(tài)。將血肽樣品配制成100 mg/mL溶液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，上樣量1.0 mL，流動(dòng)相為NaCl溶液，流速為0.5 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，洗脫液吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線，合并同一洗脫峰，洗脫液真空濃縮，冷凍干燥后得到純化后血肽樣品。

1.3.7 血肽抗氧化性試驗(yàn)

1.3.7.1 ABTS＋自由基清除率測(cè)定

參照WANG等[15]的方法。取2.45 mmol/L K2S2O8溶液和7 mmol/L ABTS溶液等體積混合，室溫25℃避光放置12h～16h制得ABTS＋自由基反應(yīng)液，用0.2mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液將0.8 mL ABTS＋自由基反應(yīng)液進(jìn)行稀釋，使其在734 nm下吸光值為0.68～0.72，備用。配制3.0 mg/mL樣液，取0.04 mL樣液與4 mL ABTS＋自由基反應(yīng)液混合均勻，常溫避光反應(yīng)1 h，測(cè)定其在734 nm下的吸光值（A1），用去離子水做空白對(duì)照測(cè)定在734 nm下的吸光值（A2），按下式計(jì)算ABTS＋自由基清除率。

1.3.7.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

參照BAEA S H等[16]的方法。取2 mL樣液（3.0 mg/mL），加入2 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液（用95%的乙醇溶解），混勻后在室溫25℃條件下避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（A1），空白組為2 mL 95%的乙醇溶液代替DPPH溶液，加入2 mL樣液混合，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A2），對(duì)照組為2 mL DPPH溶液加2 mL 95%的乙醇溶液，在517 nm處測(cè)定其吸光度（A0）。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.7.3 羥基自由基清除率測(cè)定

參照馬賽蕊等[17]的方法。取0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲的無(wú)水乙醇溶液，加入0.4 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.40）和0.6 mL 0.75 mmol/L的硫酸亞鐵，加入2 mL樣液（3.0 mg/mL），加入0.4 mL 0.1%雙氧水，37℃條件下水浴60 min，在波長(zhǎng)536 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度（A1）；以去離子水代替樣液和雙氧水溶液重復(fù)以上操作，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度（A2）；以去離子水代替樣液來(lái)重復(fù)以上操作，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A3）。按下式計(jì)算羥基自由基清除率。

1.3.7.4 O2-自由基清除率測(cè)定

參照張金豫等[18]的方法。取樣液0.1 mL（3.0 mg/mL），加入2.8 mL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.2）緩沖溶液振蕩混勻，在25℃水浴10 min后加入0.1 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚溶液（25℃預(yù)熱），在322 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，每隔30 s讀取吸光度，4 min后結(jié)束；以去離子水0.1 mL加 2.8 mL 0.1 mol/L的 Tris-HCl（pH 8.2）緩沖溶液調(diào)零；空白對(duì)照管以去離子水代替樣液。作吸光度隨時(shí)間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚的自氧化速率V，按下式計(jì)算O2-自由基清除率。

式中：V對(duì)照為鄰苯三酚自氧化速率，即自氧化曲線斜率；V樣品為加入血肽氧化曲線斜率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Excel、Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

不同底物濃度、酶添加量、酶解時(shí)間對(duì)血紅蛋白水解度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同酶解條件下雞血血紅蛋白水解度Fig.1 Degree of hydrolysis of hemoglobin in chicken blood at different enzymatic hydrolysis conditions

由圖1可知，底物濃度為5%～6%時(shí)，水解度變化不明顯，表明底物濃度大于5%時(shí)趨于飽和；隨著酶添加量增加，血紅蛋白水解度呈緩慢增加趨勢(shì)，酶添加量大于1.5%后，水解度趨于穩(wěn)定值；隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度緩慢增加。水解度直接關(guān)系到血紅蛋白水解程度，隨著水解度的增加，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布表現(xiàn)出大分子肽含量逐漸減少，小分子肽含量逐漸增多[19-20]。綜合考慮原輔料成本、生產(chǎn)周期、能耗等問(wèn)題，確定血肽酶解制備條件：底物濃度5%，酶添加量1.5%，酶解時(shí)間5 h。

2.2 血肽相對(duì)分子質(zhì)量分布

血肽高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）圖以及相對(duì)分子質(zhì)量分布見(jiàn)圖2和表1。

表1 血肽相對(duì)分子質(zhì)量分布Table 1 Relative molecular mass distribution of hemepeptide

圖2 血肽高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of hemepeptide

雞血血紅蛋白經(jīng)中性蛋白酶酶解后，酶解液中肽的相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在1 000 Da以下，1 000 Da～2 000 Da的肽含量較低，僅為2.69%，500 Da～1 000 Da的肽含量為 23.97%，180 Da～500 Da的肽含量為66.07%，低于180 Da的肽含量為6.52%，屬于氨基酸或其殘基。根據(jù)氨基酸平均相對(duì)分子質(zhì)量180 Da，可以推斷酶解液中肽大部分由2個(gè)～6個(gè)氨基酸組成，屬于小肽（或寡肽）范疇。由此可以說(shuō)明，采用上述的酶解工藝條件可以得到含量超過(guò)90%以上小肽樣品。

2.3 血肽SephadexG-15分離純化

根據(jù)表1血肽大部分相對(duì)分子質(zhì)量小于1000Da，而Sephadex G-15分離的分子質(zhì)量范圍是＜1 500 Da，因此選擇采用交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-15分離純化血肽粗品，洗脫峰見(jiàn)圖3。

圖3 血肽葡聚糖凝膠層析圖譜Fig.3 Dextran gel chromatography of hemepeptide

凝膠層析過(guò)程中多肽按照分子量大小先后被洗脫出來(lái)，共分離出P1、P2、P3與P4共4個(gè)組分，分子量大小順序依次為P1＞P2＞P3＞P4，根據(jù)各組分峰面積，4個(gè)組分含量與HPLC相對(duì)應(yīng)，分別收集P2、P3組分，冷凍干燥后研究其抗氧化活性。

2.4 血肽抗氧化活性

血肽粗品、P2組分、P3組分的 ABTS＋自由基、DPPH自由基、羥基自由基、O2-自由基的清除率結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 血肽粗品與Sephadex G-15分離組分抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activities of crude hemepeptides and Sephadex G-15 isolated components

鑒于多肽抗氧化活性存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，因此在抗氧化活性測(cè)定試驗(yàn)中，確定血肽粗品及各組分質(zhì)量濃度為3 mg/mL。結(jié)果表明，血肽粗品經(jīng)Sephadex G-15的分離純化后，多肽組分的抗氧化活性增加，且分子量越低的組分ABTS＋自由基、DPPH自由基、羥基自由基、O2-自由基的清除率越高，分離純化得到的血肽P3組分具有最強(qiáng)的抗氧化性能。肽的抗氧化活性與其分子量之間存在相關(guān)性，其活性可能隨著肽分子量的降低而增加，另外，肽的氨基酸組成、序列以及重要氨基酸所在肽鏈中位置也與多肽抗氧化性相關(guān)[21-22]。

3 結(jié)論

雞血血紅蛋白通過(guò)中性蛋白酶酶解，血紅蛋白底物濃度5%，酶添加量1.5%，酶解時(shí)間5 h，酶解液離心凍干獲得血肽粗品，血肽相對(duì)分子質(zhì)量大部分集中在1 000 Da以下，主要分布于500 Da～1 000 Da與180 Da～500 Da，含量分別為23.97%、66.07%，由此可以推斷，在此酶解工藝條件下，可以獲得2個(gè)～5個(gè)氨基酸組成的血肽分子。經(jīng)交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-15分離得到4個(gè)洗脫峰，與高效液相色譜分析結(jié)果一致。分子量180 Da～500 Da的血肽ABTS＋自由基、DPPH自由基、羥基自由基、O2-自由基的清除率分別為81.28%、52.45%、23.86%與18.14%，高于血肽粗品與500 Da～1 000 Da的血肽，表明純化后的血肽的抗氧化活性增加，且分子量小的血肽抗氧化活性較高。