HPLC法測定芪藍(lán)囊病飲中的靛玉紅

牛華星，章安源，趙 見, 郭 騰，李有志，尹伶靈，劉少寧，陳 玲，魏秀麗，張志民，張傳津*

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南 250022；2.日照市東港區(qū)濤雒計(jì)生委,日照 276800)

芪藍(lán)囊病飲是收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017卷的純中藥制劑[1]，主要成分為黃芪、板藍(lán)根、大青葉、地黃、赤芍，具有提高疫苗免疫應(yīng)答效果(參考說明書的功能主治)。目前本制劑標(biāo)準(zhǔn)只是對(duì)黃芪、板藍(lán)根、大青葉進(jìn)行定性薄層鑒別，缺少對(duì)有效成份定量控制。有文獻(xiàn)表明[2-3]，靛玉紅(indirubin)是大青葉、板藍(lán)根的主要指標(biāo)成分，因此本文主要開展了反相高效液相色譜法測定靛玉紅方法學(xué)研究，為完善芪藍(lán)囊病飲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥 Waters e-2695(配二極管陣列檢測器2998)；靛玉紅對(duì)照品(批號(hào)：110717-200204)(中國藥品生物檢定所)；乙腈(色譜純)；磷酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水；供試品：芪藍(lán)囊病飲口服液(某公司提供，批號(hào)：202006271，202006281，202006291，202007271，202007281，202007291)，陰性空白制劑自制；其他試劑均為分析純。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.2%磷酸水溶液；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。檢測波長為289 nm，梯度洗脫條件見表1；

表1 梯度洗脫條件

1.2.2 溶液的制備 取13.58 mg靛玉紅對(duì)照品，精密稱定，加三氯甲烷配制成1358 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取1 mL儲(chǔ)備液用甲醇制成67.9 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次倍比稀釋成系列濃度：2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

取1 mL供試品溶液于50 mL，離心管中，加入9 ml三氯甲烷，振搖1 min，靜置分層棄去上清液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。另取不含大青葉的陰性空白制劑，同法制成陰性空白對(duì)照溶液。

1.2.3 專屬性試驗(yàn) 分別吸取10 μL“1.2.2”項(xiàng)下陰性空白對(duì)照溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在靛玉紅對(duì)照品相應(yīng)色譜峰位置處無其他色譜峰出現(xiàn)(圖1)。

圖1 陰性供試品溶液(A)供試品溶液(B)靛玉紅對(duì)照品溶液(C)

1.2.4線性關(guān)系考察 分別吸取“1.2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下，使用梯度洗脫方法，可以有效分離目標(biāo)峰，靛玉紅在0.5～2.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖2)。

圖2 靛玉紅溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.5 重復(fù)性與穩(wěn)定性 精密量取同批供試品1 mL,按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，注入液相色譜儀，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，靛玉紅峰面積RSD為 1.4 %。說明樣品重復(fù)性良好。

將其中一份供試品溶液，取10 μL分別于放置后2、5、7、12 h注入液相色譜儀，記錄色譜圖，靛玉紅峰面積RSD為1.4%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.6 精密度試驗(yàn) 取“1.2.2”項(xiàng)下靛玉紅對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，靛玉紅峰面積RSD為0.4 %。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

1.2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品1 mL，精密加入10.1850 μg/mL的靛玉紅對(duì)照品0.5 mL，制備陽性添加供試品6份。按“1.2.2”項(xiàng)下方法供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率計(jì)算加樣回收率(表2)?；厥章试?9.2%～92.4%之間，RSD為1.34%。表明該方法回收率好，準(zhǔn)確度滿足檢測要求。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(μg/mL，n=6)

1.2.8 樣品的測定 精密量取6批芪藍(lán)囊病飲進(jìn)行測定。分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果測定6批芪藍(lán)囊病飲中靛玉紅的含量(表3)。

1.2.9 不同儀器相同色譜條件下樣品檢測比較 使用waters e2695和agilent高效液相色譜儀，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件運(yùn)行，對(duì)出峰時(shí)間和含量進(jìn)行比較(表3)，結(jié)果表明:芪藍(lán)囊病飲中靛玉紅的平均含量，相對(duì)偏差1.52%。結(jié)果表明，該方法在不同儀器上，檢測結(jié)果穩(wěn)定。

表3 不同儀器相同色譜條件結(jié)果表(μg/mL，n=6)

2 討論與結(jié)論

2.1 指標(biāo)成分的選取[4-6]板藍(lán)根、大青葉是芪藍(lán)囊病飲的主要藥成分。板藍(lán)根別名靛青根、藍(lán)靛根、靛根，是十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)的干燥根，含有靛玉紅、吲哚苷、多種氨基酸、β-古甾醇、植物性蛋白、糖類等成分。大青葉是十字花科菘藍(lán)屬植物菘藍(lán)的干燥葉，含有靛玉紅、靛藍(lán)、菘藍(lán)苷B、扶桑甾醇、芥苷類多種成分。其中靛玉紅為板藍(lán)根、大青葉中含量較高的主要成分，化學(xué)研究表明靛玉紅可作為藥材和其制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。大青葉中另一含量較高的成分為靛藍(lán)，靛藍(lán)與靛玉紅為同分異構(gòu)體，靛藍(lán)分子中的氫鍵小于靛玉紅，其性質(zhì)不穩(wěn)定，不耐光和熱。本文只選擇靛玉紅作為指標(biāo)成分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 提取溶劑的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)相關(guān)方法[7-9]，實(shí)驗(yàn)比較了甲醇，乙醚，氯仿，二甲基甲酰胺等溶劑的提取效果。采用“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣，比較峰面積值，結(jié)果顯示，甲醇提取效果較差，二甲基甲酰胺提取效果較好，靛玉紅在乙醚，氯仿中提取效果最好，因乙醚對(duì)c18色譜柱有一定損害，最終選擇氯仿為供試品提取溶劑。

2.3 提取方式選擇 實(shí)驗(yàn)比較了不同提取方式對(duì)制劑中靛玉紅提取效率的影響。精密量取芪藍(lán)囊病飲供試品1 mL于玻璃試管中，加入9 mL氯仿，分別采取，振搖，超聲。采用“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣，比較峰面積值，結(jié)果顯示，振搖，超聲的提取效率基本一致。為方便實(shí)驗(yàn)操作，選擇振搖作為本方法測試藥物的提取方式。

2.4 流動(dòng)相的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)相關(guān)方法[10-11]，大青葉，青黛和小兒清咽顆粒中靛玉紅的采用不同比例的甲醇水或乙腈水為流動(dòng)相分別測定，在此基礎(chǔ)上探討對(duì)比不同的流動(dòng)相及流動(dòng)相比例，對(duì)芪藍(lán)囊病飲中的靛玉紅進(jìn)行測定。選用甲醇-水(75∶25，V∶V),(80∶20，V∶V)；甲醇-1%醋酸(50∶50，V∶V)，乙腈-水(53∶47，V∶V)四種流動(dòng)相，比較色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水(53∶47，V∶V)，靛玉紅的峰形較好，但是仍與供試品溶液其他成分峰不易分離。本實(shí)驗(yàn)最終將流動(dòng)相優(yōu)化為乙腈-0.2%磷酸水，并進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)供試品中靛玉紅與其他成分分離較好。在waters e2695(PDA)與Agilent1260 infinityⅡ(PDA)上，多次進(jìn)樣，專屬性好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.5 影響含量測定的因素 影響芪藍(lán)囊病飲中靛玉紅的含量差異因素很多，原料藥材產(chǎn)地、采收期、投料和加工工藝，都會(huì)使靛玉紅的含量有所差異。所以，對(duì)制劑中有效成分進(jìn)行定量控制非常必要。

研究建立了HPLC法測定芪藍(lán)囊病飲中靛玉紅的含量，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法前處理簡單，色譜分離較好，可為完善芪藍(lán)囊病飲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。