QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛奶中11種激素類藥物殘留

陳 娟,李永琴,卜寧霞,馬 巖,楊 奇

(寧夏獸藥飼料監(jiān)察所,寧夏銀川，750011)

激素類藥物對(duì)動(dòng)物生理過(guò)程起著重要調(diào)節(jié)作用，可用于治療動(dòng)物疾病，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量、增加蛋白沉積等[1]。奶牛在哺乳期會(huì)分泌一定量的激素，但養(yǎng)殖者為了加速奶牛發(fā)育和延長(zhǎng)哺乳期會(huì)人為加入外源激素，并通過(guò)血液循環(huán)在牛乳中積累[2]，牛乳中蓄積的激素藥物會(huì)對(duì)人體健康造成較大危害，如增加生殖系統(tǒng)癌癥風(fēng)險(xiǎn)[3-4]、誘發(fā)免疫性疾病[5]和影響兒童生長(zhǎng)發(fā)育等[6]，因此歐盟禁止在動(dòng)物生產(chǎn)中使用激素藥物[7]，我國(guó)也在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》(GB 31650-2019)和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號(hào)公告中分別對(duì)限用和禁用的激素類藥物做出了相應(yīng)規(guī)定[8-9]。

目前，國(guó)內(nèi)外激素類藥物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[11-12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[13-15]等，HPLC-MS具有樣品前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于激素類痕量藥物殘留測(cè)定。但針對(duì)牛奶中激素檢測(cè)方法的相關(guān)研究較少，且檢測(cè)藥物種類少、覆蓋面窄，Liu Kun[10]等建立了牛奶中5種激素的自動(dòng)在線固相萃取-高效液相色譜聯(lián)用的檢測(cè)方法，尤亮亮[13]等利用固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了牛奶中9種性激素殘留。同時(shí)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜法》(GB/T 21981-2008)中對(duì)激素殘留測(cè)定的前處理方法繁瑣、費(fèi)時(shí)、成本高[16]，不能夠滿足快節(jié)奏、大批量的檢測(cè)需求。

QuEChERS法是一種快速、簡(jiǎn)易、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全的前處理方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域[17]。本研究利用QuEChERS法，通過(guò)優(yōu)化前處理方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)群勃龍、諾龍、甲基睪酮、睪酮、黃體酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、勃地龍、司坦唑醇、美雄酮、丙酸睪酮共11種藥物快速、高效的定性定量測(cè)定，可為牛奶中激素類藥物監(jiān)控提供技術(shù)支撐，保障牛奶質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC-Xevo TQ-s micro超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；AE-205電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；CT15RT高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司)；氮吹儀(美國(guó)Organomation Associates公司)；Milli-Q integra 5超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；多管渦旋振蕩器(安簡(jiǎn)(北京)科技有限公司)。

1.2 試劑與材料

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品 群勃龍、諾龍、甲基睪酮、睪酮、黃體酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、勃地龍、司坦唑醇、美雄酮、丙酸睪酮藥物標(biāo)照品(純度≥95 %，除苯丙酸諾龍來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院、美雄酮來(lái)源于上海安譜公司外，其他標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)源于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2.2 材料 Cleaner MAS-Q 凈化管(天津博納艾杰爾有限公司)；乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；乙酸乙酯(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲酸(質(zhì)譜純，美國(guó)Fisher公司)；所用水為超純水。

1.3 UPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱為美國(guó) Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A相為乙腈，B相為0.1 %甲酸水溶液；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：1.0 kV；源溫：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；霧化氣流速：1000 L/h；錐孔氣流速：50 L/h。11種激素類藥物定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 11種待測(cè)藥物質(zhì)譜條件

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品提取 準(zhǔn)確稱取混勻后的牛奶樣品(2±0.05) g，置于50 mL塑料離心管內(nèi)，加入乙酸乙酯10 mL，旋渦提取5 min，10000 r/min離心5 min，取上清液于15 mL具塞玻璃試管中，45 ℃氮?dú)獯抵两?。殘留物? mL0.1 %甲酸乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1)溶解。

1.4.2 樣品凈化 取上清液1.5 mL至Cleanert MAS-Q凈化管中，渦旋振蕩1 min，10000 r/ min離心5 min，取上清液過(guò)微孔濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：分別精密稱取11種激素類藥物對(duì)照品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配置成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃可保存6個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成適宜濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用空白樣品提取液配成濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10、50、100 ng/mL的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，從低濃度到高濃度測(cè)定，每一濃度進(jìn)樣3針，以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系 精密量取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用空白基質(zhì)稀釋成含各藥物濃度分別為0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，充分混勻，過(guò)微孔濾膜，作為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程。圖1為0.5～100 ng/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，11種激素類藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)r見(jiàn)表3，由表3可以看出，11種藥物在0.5～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r均大于0.998。

圖1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(0.5～100 ng/mL)

表3 11種激素類藥物線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 定量限 添加適量100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白牛奶中，前處理后測(cè)定，依據(jù)各工作溶液對(duì)應(yīng)峰的信噪比S/N>10(按PtP算)，確定出激素類藥物的定量限為1 μg/kg。

2.3 方法精密度與準(zhǔn)確度 在空白牛奶中分別添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成1、2、10 μg/kg三個(gè)不同濃度的空白添加試樣，每批次同一濃度做5次平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，由表4可以看出，空白牛奶中添加11種激素類藥物添加回收率均在60.3 %～119.6 %；批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7 %～10.9 %；批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.2 %～12.1 %，完全符合我國(guó)關(guān)于獸藥殘留檢測(cè)試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范的要求[23]。1 ng/mL空白牛奶基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中11種激素類藥物特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖2。

表4 11種激素類藥物的加標(biāo)回收率和精密度(n=5)

圖2 11種激素類藥物特征離子質(zhì)量色譜圖(1.0 ng/mL)

3 討論與結(jié)論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)采用各藥物0.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在電噴霧離子源正、負(fù)離子模式下，采用流動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行全掃描，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：這11種激素類藥物均在正離子模式下響應(yīng)強(qiáng)度大，在此基礎(chǔ)上選擇豐度較強(qiáng)、干擾最少的兩個(gè)子離子作為定性離子，其中豐度最強(qiáng)的子離子作為定量離子，同時(shí)確定出最佳碰撞能量和錐孔電壓，具體質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表2。

3.2 提取溶劑的確定 目前，國(guó)內(nèi)外激素類藥物殘留檢測(cè)常用的提取溶劑主要為乙腈[10、18]、叔丁基甲醚[19]、乙酸乙酯[20]等。因此，實(shí)驗(yàn)采用空白添加法，分別考察了乙酸乙酯、乙腈、1 %甲酸乙腈溶液和叔丁基甲醚作為提取溶劑的提取效率。結(jié)果表明：叔丁基甲醚提取效率較低，乙酸乙酯和乙腈提取效率較高，但乙腈易使牛奶中的蛋白質(zhì)變性、乳化，影響提取效果[21]，且作為提取劑也會(huì)將牛奶中的水分也提出，降低氮吹濃縮速度，因此選擇乙酸乙酯為提取溶劑。

3.3 凈化方法的確定 QuEChERS凈化方式所使用的吸附劑可將樣品中的雜質(zhì)、有機(jī)成分通過(guò)吸附、凈化作用除去，減小樣品基質(zhì)對(duì)提取液中目標(biāo)化合物的干擾，尤其是高蛋白、高脂肪的牛奶樣品。實(shí)驗(yàn)采用HLB柱(500 mg/6 mL)、HLB柱(60 mg/3 mL)和Cleaner MAS-Q凈化管分別對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，考察樣品凈化效果和目標(biāo)藥物回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種方法均能起到較好的凈化效果，但采用兩種HLB柱凈化后，丙酸睪酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍和司坦唑醇4種藥物回收率較低(僅為20 %～50 %)，而采用Cleaner MAS-Q凈化管凈化后，11種藥物回收率在60 %～120 %，這可能是因?yàn)镃leaner MAS-Q凈化管中的吸附劑填料較為豐富，主要有PSA、PC、C18和MgSO4，其中PSA對(duì)脂類和糖類的去除效果較好，C18可去除脂類等物質(zhì)[22]，因此，為保證凈化效果和回收率，實(shí)驗(yàn)選擇Cleaner MAS-Q凈化管凈化樣品，同時(shí)此方法還可在凈化后直接收集上清液，過(guò)濾膜后上機(jī)檢測(cè)，節(jié)省傳統(tǒng)方法中的固相萃取和濃縮步驟，具有快速、節(jié)約、簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)。

研究建立了QuEChERS前處理方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中11種激素類藥物殘留的檢測(cè)方法。樣品用乙酸乙酯提取，離心后氮吹濃縮，經(jīng)0.1 %甲酸50 %乙腈水溶液復(fù)溶后用Cleanert MAS-Q凈化管凈化，過(guò)微孔濾膜后供UPLC- MS/MS測(cè)定。該方法在優(yōu)化前處理方式后具有快速、節(jié)約、簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，并在0.5～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r均大于0.998。在1～10 μg/kg添加水平下，藥物添加回收率均在60.3 %-119.6 %，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～10.9 %，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.2 %～12.1 %，定量限為1 μg/kg。該方法簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確、靈敏度高，可滿足對(duì)牛奶中多種激素藥物殘留監(jiān)測(cè)的需要。