一株重組類NADC30豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及基因組分析

楊 康，袁林茂，張維達(dá)，李自力*

(1.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070；2.上海新農(nóng)飼料股份有限公司，上海201600)

豬繁殖與呼吸綜合征俗稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起豬繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)損傷的高度接觸性傳染病，病豬和帶毒豬是主要傳染源[1]。該病最早于1987年在美國被報(bào)道，隨后在許多國家出現(xiàn)。PRRSV分為兩個(gè)基因型，即以LV為代表的歐洲型和以VR2332為代表的美洲型[2-3]。1996年，郭寶清等[4]在中國首次分離到PRRSV CH-1a株。2006年，田克恭等[5]首次報(bào)道中國暴發(fā)高熱病，后確定是由高致病性PRRSV(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV)所致，其Nsp2基因存在30(1+29)個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失(相對于CH-1a)，這是判斷HP-PRRSV的重要分子特征。2008年，在美國報(bào)道了一株 Nsp2 基因存在131個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失的PRRSV，命名為NADC30[6]。2013年，周峰等[7]對河南省豬繁殖與呼吸綜合征進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了與美國NADC30同源性較高的毒株，由于這類毒株與NADC30親緣關(guān)系較近，國內(nèi)現(xiàn)將該類病毒統(tǒng)稱為類NADC30 PRRSV(NADC30-like PRRSV)。目前我國大部分省份均有類NADC30株檢出，且陽性率逐年上升，類NADC30株現(xiàn)已成為多地的優(yōu)勢毒株。

PRRSV具有變異快的特點(diǎn)，特別是其非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2、結(jié)構(gòu)蛋白GP5變異最大，已有許多依據(jù)Nsp2及ORF5作為PRRSV遺傳進(jìn)化及基因分型的相關(guān)報(bào)道[8-9]。Shi等[10]對全球8624份PRRSV ORF5基因序列進(jìn)行分析，將北美型PRRSV分為9個(gè)譜系(lineage1～9)。目前我國PRRSV分為4個(gè)譜系：lineage 1、lineage 3、lineage 5.1和lineage 8。也有國內(nèi)學(xué)者根據(jù)Nsp2序列的差異，將我國PRRSV分為經(jīng)典PRRSV、HP-PRRSV、類NADC30 PRRSV、疫苗毒株等。

目前商品化的疫苗主要針對經(jīng)典PRRSV和HP-PRRSV。Bai等[11]建立了類NADC30 PRRSV的攻毒模型，評價(jià)了幾種最主要的商品化疫苗的保護(hù)效力，證明現(xiàn)有疫苗不能對類 NADC30 PRRSV提供完全保護(hù)。因此，類NADC30株的分離工作意義重大。本研究旨在分離類NADC30株并分析其分子遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，從而為上海地區(qū)的豬繁殖與呼吸綜合征防控提供參考，為進(jìn)一步研究其重組機(jī)制、致病特點(diǎn)及研制預(yù)防類NADC30 PRRSV疫苗等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 2份疑似豬繁殖與呼吸綜合征肺臟病料采自上海某豬場發(fā)病豬；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存；HP-PRRSV(XJ株)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存；pMD18-T克隆載體購自大連寶生物有限公司；胎牛血清購自Gbico公司；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；高保真DNA聚合酶(Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase，P505-d1)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R223-01)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購自ABclonal 公司；抗PRRSV GP5的單克隆抗體(MAb)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院李建惠贈。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 依照周峰[7]設(shè)計(jì)鑒別引物的原理，參考經(jīng)典PRRSV CH-1a(AF132118)、HP-PRRSV JXA1(EF112445)、NADC30 PRRSV(MH500766)Nsp2基因序列，使用SnapGene設(shè)計(jì)Nsp2特異性鑒別引物(上游引物：5’-TGATTGGAATGTTGTGCTTCCTGGG-3，下游引物：5’-TGTCAAGCGTGAGAATCACACGCCC-3’)，可擴(kuò)增出經(jīng)典PRRSV(1047 bp)、HP-PRRSV(957 bp)、類NADC30 PRRSV(654 bp)；根據(jù)NADC30(MH500766)的基因組序列設(shè)計(jì)10對重疊基因片段引物(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 全基因擴(kuò)增引物

1.3 豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)的獲取 參照孟春花等[12]所采用的方法制備并保存豬肺泡巨噬細(xì)胞。

1.4 病料處理和RT-PCR檢測 將1 g肺組織剪碎加入裝有適量PBS的離心管中，加入鋼珠后將離心管置于組織破碎儀中充分破碎，離心取上清后參照張維達(dá)等[13]報(bào)道的方法提取總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min、35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。取適量PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 病毒的分離、鑒定及純化 將步驟1.4中經(jīng)RT-PCR檢測呈陽性的樣品接種于鋪滿單層PAMs的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)3～5 d。接種后每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，盲傳3代后收集細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)RT-PCR鑒定。經(jīng)RT-PCR檢測為陽性的細(xì)胞上清接種PAMs，培養(yǎng)48 h后，用4%甲醛室溫固定30 min，0.1%Triton X-100室溫穿透15 min，使用1∶200稀釋抗PRRSV-GP5單克隆抗體于37 ℃孵育1 h，再用1∶500稀釋FITC標(biāo)記羊抗鼠 IgG 37 ℃孵育1 h，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞作為對照，經(jīng)IFA鑒定。

按照王培培所采用的方法[14]進(jìn)行病毒噬斑純化。使用PAMs擴(kuò)繁病毒，將收獲的病毒液經(jīng)超濾濃縮，蔗糖密度梯度離心后經(jīng)透射電鏡檢測。

1.6 分離株的基因組擴(kuò)增、克隆和測序 將分離株按照步驟1.4的操作提總RNA，經(jīng)RT-PCR分段擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化回收后連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒由上海生物工程股份有限公司測序。

1.7 基因序列同源性以及遺傳進(jìn)化分析 利用軟件SeqMan(version 7.1.0)對測序結(jié)果進(jìn)行重疊片段序列拼接，采用軟件MegAlign(version 7.1.0)和MEGA(version 6.0)對分離株全基因組序列與GenBank登錄的國內(nèi)外毒株全基因組序列進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析，同時(shí)對分離株Nsp2與GP5氨基酸序列進(jìn)行同源性及遺傳進(jìn)化分析，利用軟件SimPlot(version 3.5.1) [200 bp window sliding along the genome alignment (20-bp step size)]對分離株全基因組序列和參考株基因序列進(jìn)行重組分析。

1.8 分離株對Marc-145細(xì)胞的嗜性分析 將分離株接種Marc-145細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，接種48～72 h后經(jīng)RT-PCR檢測PRRSV核酸，同時(shí)經(jīng)IFA檢測PRRSV GP5，將收獲的細(xì)胞上清傳代培養(yǎng)3次，評價(jià)分離株的細(xì)胞嗜性。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床樣品的檢測 以患病豬肺臟RNA為模板，針對PRRSV Nsp2基因的鑒別引物進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示1號肺樣為弱陽性，2號肺樣為強(qiáng)陽性，且擴(kuò)增條帶為654 bp，陽性對照擴(kuò)增出957 bp條帶(圖1)。將2號肺樣的PCR產(chǎn)物送測序，經(jīng)BLAST序列比對，發(fā)現(xiàn)樣品中病毒和NADC30的部分Nsp2基因的同源性較高。

M：DL2000 Marker；1：1號肺樣；2：陰性對照；3：2號肺樣；4：陽性對照(XJ，HP-PRRSV)

2.2 病毒的分離鑒定 將檢測為陽性的樣品經(jīng)0.22 μm濾器過濾后接種PAMs，在PAMs中連續(xù)傳代3代后可出現(xiàn)穩(wěn)定且典型的細(xì)胞病變(CPE)，使用臺盼藍(lán)對接種72 h的細(xì)胞培養(yǎng)物染色，經(jīng)普通光學(xué)顯微鏡觀察，可見細(xì)胞脫落、破碎(圖2B)。使用鼠抗PRRSV GP5單克隆抗體和FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG對感染48 h的PAMs進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，經(jīng)熒光顯微鏡觀察，可見接種陽性樣品的PAMs呈現(xiàn)綠色熒光，為抗原陽性反應(yīng)(圖2D)。

將噬斑純化后擴(kuò)大培養(yǎng)并儲存，將制備好的病毒樣品經(jīng)透射電鏡觀察，可見直徑為50 nm左右的圓形顆粒(圖2E)。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明成功分離出一株P(guān)RRSV，將其命名為SH2019。

2.3 PRRSV的全基因組擴(kuò)增，同源性及遺傳進(jìn)化分析

2.3.1 PRRSV的全基因組擴(kuò)增 將病毒約為15 kb的全基因組序列按參考株NADC30分為10個(gè)重疊基因片段，使用10對引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如下所示(圖3)，序列拼接結(jié)果顯示SH2019的全基因組大小為14677 bp(不含5'UTR和3'UTR)。

M：DL2000 Marker；A～J：單個(gè)基因片段；N：陰性對照

2.3.2 分離株全基因組的同源性分析及遺傳進(jìn)化分析 將拼接完的全基因組序列與GenBank登錄的參考毒株序列進(jìn)行同源性分析和遺傳進(jìn)化分析。同源性比對結(jié)果顯示，分離株SH2019與歐洲型代表株LV的同源性為60.5%，與北美型PRRSV的同源性在82.5%～91.3%，與NADC30的同源性最高，為91.3%。遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，SH2019與中國本土類NADC30株HENAN-XINX、CHsx1401有很近的親緣關(guān)系，這些分離株歸屬在流行于中國大陸的北美型PRRSV譜系1中(圖4A和4B)。上述結(jié)果表明，分離株SH2019屬于類NADC30 PRRSV。

分離株用▲標(biāo)注(the isolate was marked with ▲)

2.4 分離株Nsp2、ORF5基因編碼的氨基酸序列分析

2.4.1 分離株Nsp2基因編碼氨基酸序列的不連續(xù)缺失分析 氨基酸序列比對結(jié)果顯示，分離株SH2019相對于經(jīng)典毒株(CH-1a)在Nsp2中存在NADC30特征性的131(111+1+19)個(gè)氨基酸缺失(圖5)。

分離株用＿標(biāo)注(the isolate was marked with＿)

2.4.2 分離株Nsp2、ORF5基因編碼氨基酸序列的同源性及遺傳進(jìn)化分析 根據(jù)Nsp2、GP5氨基酸序列同源性比對結(jié)果，分離株SH2019與歐洲代表株LV的Nsp2氨基酸序列同源性僅為49.8%，但與NADC30的同源性最高，為89.9%；分離株SH2019與歐洲型代表株LV的GP5氨基酸序列同源性最低，為54.6%，與NADC30的同源性最高，為89.4%。Nsp2、GP5氨基酸序列的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，分離株SH2019與中國本土類NADC30株HENAN-XINX、CHsx1401及北美株NADC30屬于同一個(gè)譜系(圖6)。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，分離株SH2019屬于類NADC30 PRRSV。

分離株用▲標(biāo)注(the isolate was marked with ▲)

2.5 分離株的基因組重組分析 以分離株SH2019全基因組序列為查詢序列，根據(jù)軟件Simplot分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)全基因組有3個(gè)重組斷點(diǎn)(12601 nt、12761 nt、12901 nt)，將分離株SH2019全基因組分為4個(gè)片段(圖7A)。片段1～12600 nt和片段12902～14677 nt與NADC30的同源性最高，分別為91.0%和93.4%；片段12601～12761 nt與QYYZ的同源性最高，為91.3%；片段12762～12901 nt與BJ-4或JXA1的同源性最高，均為94.2%。進(jìn)一步將4個(gè)基因片段分別制作遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果見圖7B。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，分離株SH2019是以譜系1(代表株NADC30)的毒株為主要親本，以譜系3(代表株QYYZ)、譜系5(代表株VR2332、BJ-4)或譜系8(代表株JXA1)的毒株為次要親本，在12601～12901 nt(ORF2～ORF4)發(fā)生了基因重組。上述結(jié)果表明，分離株SH2019是發(fā)生基因重組的類NADC30 PRRSV。

與分離株SH2019處于同一譜系的毒株均標(biāo)注▲

2.6 分離株對Marc-145細(xì)胞的嗜性分析 將分離株SH2019接種Marc-145細(xì)胞48～72 h后，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)CPE，同時(shí)經(jīng)RT-PCR、IFA檢測分離株能否感染Marc-145細(xì)胞。結(jié)果顯示，并未觀察到明顯的CPE，RT-PCR、IFA檢測也均為陰性，傳3代每代檢測都為陰性。第3代細(xì)胞培養(yǎng)物的IFA檢測結(jié)果見圖8。上述結(jié)果表明，分離株SH2019對Marc-145細(xì)胞無嗜性。

圖8 分離株對Marc-145細(xì)胞的嗜性分析(100×)

3 結(jié)論與討論

自2013年首次發(fā)現(xiàn)類NADC30 PRRSV以來[7]，這類毒株便在我國迅速流行，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。由于現(xiàn)階段商品化疫苗僅能對類NADC30 PRRSV提供部分保護(hù)力[11]，因此分離類NADC30 PRRSV具有一定應(yīng)用價(jià)值，可為以后研制相關(guān)疫苗奠定基礎(chǔ)。

本研究最初采用Marc-45細(xì)胞分離PRRSV，將經(jīng)RT-PCR檢測為陽性的臨床樣品接種Marc-145細(xì)胞后，鏡檢未發(fā)現(xiàn)CPE，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)RT-PCR檢測也呈陰性，因此改用PAMs分離病毒。張洪亮等[15]報(bào)道的15株類NADC30 PRRSV中有13株病毒只能感染PAMs而不能感染Marc-145細(xì)胞；阮海宇等[16]用Marc-145細(xì)胞對類NADC30 PRRSV嘗試進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)該毒株在Marc-145上適應(yīng)性不好，不能直接用Marc-145分離該病毒。由于很多類NADC30株不能在Marc-145細(xì)胞中復(fù)制，而PAMs的獲取成本較高，所以研制預(yù)防類NADC30株的疫苗具有較大難度。由此構(gòu)建對類NADC30株高敏感性的細(xì)胞系可為疫苗的研制提供一條路徑。

類NADC30株較經(jīng)典PRRSV和HP-PRRSV具有更高的重組概率，目前很多類NADC30株以NADC30為主要親本，以譜系3、5、8中的毒株為次要親本，在不確定的基因組位置發(fā)生重組。例如Liu等[17]分離的類NADC30株(FJLIUY-2017)是以NADC30為主要親本，以類VR2332株(12013 ～13282 nt)、類QYYZ株(13857 ～15140 nt)、類JXA1株(1～709 nt、1274～1829 nt、6890～9528 nt及11806～11524 nt)為次要親本進(jìn)行基因重組的毒株。目前關(guān)于類NADC30株發(fā)生重組的具體機(jī)制尚無準(zhǔn)確認(rèn)知，重組病毒的生物學(xué)特性可能會發(fā)生改變，越來越多重組毒株的出現(xiàn)給我國豬繁殖與呼吸綜合征的防控和凈化帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

Zhang等[18]通過反向遺傳學(xué)技術(shù)證明類NADC30株(MY-376，只能感染PAMs，而不能感染Marc-145細(xì)胞)的次要結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP3決定了其對Marc-145細(xì)胞的嗜性。目前一般認(rèn)為PRRSV入侵細(xì)胞包含以下幾步：首先PRRSV顆粒的異源二聚體(GP5/M)通過和胞膜上的硫酸乙酰肝素(pHS)互作而聚集在細(xì)胞表面，但是該作用較弱，接著唾液酸黏附素(pSn)與GP5/M相互結(jié)合強(qiáng)化第一步的吸附作用，并在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下，病毒-受體復(fù)合物內(nèi)化進(jìn)入胞內(nèi)體，并且這種配體-受體的互作十分依賴于pSn的唾液酸結(jié)合能力。隨后病毒顆粒的次要結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)合物(GP2a/GP3/GP4)與必需受體pCD163互作并在胞內(nèi)體酶的酸性條件下介導(dǎo)PRRSV脫衣殼和基因組釋放，其中GP2a 184位天冬酰胺的N-糖基化對互作起了關(guān)鍵的作用[19]，其他受體(vimentin、CD151、DC-SIGN)也在PRRSV侵入過程中發(fā)揮了一定作用。對分離株SH2019 GP2a糖基化位點(diǎn)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其同樣具有GP2a 184位天冬酰胺的N-糖基化現(xiàn)象，由此推測不太可能是GP2a與CD163互作的改變而影響分離株的細(xì)胞嗜性。由于分離株在ORF2～ORF4的基因組位置上和類QYYZ、類VR2332或類JXA1株發(fā)生了重組，推測可能是基因重組導(dǎo)致了分離株SH2019不能感染Marc-145細(xì)胞，但是還需要進(jìn)一步研究來解釋該現(xiàn)象。也有實(shí)驗(yàn)室通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PAMs CD163(pCD163)的Marc-145細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)與野生型細(xì)胞相比，Marc-145pCD163可成功感染類NADC30株(SD17-38)，且經(jīng)過多次重復(fù)驗(yàn)證，該毒株并不能在野生型Marc-145細(xì)胞中成功復(fù)制[20]。由于Marc-145細(xì)胞與PAMs均表達(dá)CD163蛋白，這提示不同物種間CD163蛋白的差異性也可能與類NADC30株的細(xì)胞嗜性有關(guān)。

本研究分離鑒定了一株重組類NADC30 PRRSV，豐富了類NADC30株的信息，可為上海地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的臨床防控提供參考。