禽腺病毒12個(gè)血清型代表毒株的分子生物學(xué)鑒定研究

侯力丹，宋佳誠，劉 丹，毛婭卿，楊亞希，黃小潔，吳應(yīng)凱，王 嘉*，李俊平*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；3. 國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽 471000)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，曾稱為I群FAdV，可根據(jù)其分子生物學(xué)特征及限制性內(nèi)切酶片段圖譜等方法分為A～E共5個(gè)種，12個(gè)血清型[1]，其多個(gè)種和血清型的特征為FAdV的鑒定、檢驗(yàn)及診斷方法建立和相關(guān)疫苗評(píng)價(jià)等帶來很大挑戰(zhàn)。FAdV可引起雞包涵體肝炎(IBH)、心包積液綜合征(HPS)和肌胃糜爛 (GE) 等病癥，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)[2-4]。自2015年6月以來，我國山東、河南、河北等省份的部分地區(qū)雞群中發(fā)生了由血清4型FAdV引起的以心包積液和肝臟腫大為特征的傳染病，被稱為雞心包積液-肝炎綜合征(HHS)[5-7]。近期也報(bào)道了血清4型的I群FAdV在水禽中的感染病例[8]。除血清4型外，F(xiàn)AdV-8a、FAdV-8b、FAdV-10及FAdV-11等血清型在我國雞群中均有流行和感染，對(duì)我國養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重影響[9-10]。目前，我國尚無商品化FAdV疫苗及診斷制品。因此，建立12個(gè)血清型FAdV代表毒株庫對(duì)于FAdV疫苗及診斷制品研發(fā)、評(píng)價(jià)等具有重要意義。

我國于20世紀(jì)70年代從國外引進(jìn)了12個(gè)血清型毒株[11]，但一直未進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。本研究針對(duì)FAdV不同種的Hexon和Fiber序列設(shè)計(jì)引物，擬經(jīng)PCR擴(kuò)增和遺傳進(jìn)化分析，對(duì)12個(gè)毒株進(jìn)行基因分種鑒定。再結(jié)合同一種中不同血清型病毒Hexon序列上酶切位點(diǎn)的特征，通過限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，得到不同的酶切片段，確定同一種內(nèi)不同血清型的病毒毒株種是否純凈，進(jìn)一步完善12個(gè)血清型代表毒株毒種庫。

1 材料和方法

1.1 毒株和試劑 FAdV的12個(gè)血清型毒株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保存。Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自康寧生命科學(xué)有限公司?？旖菪铜傊悄zDNA回收試劑盒Ⅱ型購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。TOP10感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司。LB瓊脂、LB肉湯購自北京中海生物科技有限公司；pESAY-Blunt Simple Cliong Vector購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Acc65 Ⅰ、Hpa-Ⅰ、BsaBⅠ、AlwNⅠ、SacⅡ限制性內(nèi)切酶購自NEB(北京)有限公司。KOD FX Neo 購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。2×Taq PCR Master Mix購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上FAdV不同型的參考毒株(表1)序列設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增不同種FAdV的Hexon基因和Fiber基因全長片段，引物信息分別見表2和表3。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 FAdV的12種血清型參考毒株信息

表2 針對(duì)FAdV不同種Hexon全長基因擴(kuò)增所需引物序列

表3 針對(duì)FAdV不同種Fiber全長基因擴(kuò)增所需引物序列

1.3 FAdVHexon基因和Fiber基因的PCR擴(kuò)增 使用DNA提取試劑盒分別提取12個(gè)血清型病毒DNA。以提取的DNA為模板，每對(duì)Fiber引物擴(kuò)增所有毒株，Hexon引物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)種的毒種。PCR反應(yīng)體系為上下游引物各3 μL，KOD FX Neo 1 μL，KOD FX Neo buffer 25 μL，dNTP 10 μL，ddH2O 9 μL。

PCR反應(yīng)條件為 94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃ 15 s，退火30 s，68 ℃ 按2000 bp/min延伸，共35個(gè)循環(huán)，68 ℃延伸10 min，4 ℃保存，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后使用膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收。

1.4 FAdVHexon基因和Fiber基因序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析 將上一步得到的FAdVHexon基因和Fiber基因全長片段的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，并用DNA STAR軟件對(duì)序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。將待檢毒株序列與參考毒株序列進(jìn)行同源性比較和分析。

1.5Hexon基因的酶切鑒定 由于表3中的Fiber基因引物具有種特異性，所以前期通過對(duì)Fiber基因的PCR擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)對(duì)毒株種的分型和確定種的純凈性，并實(shí)現(xiàn)對(duì)血清1型(A種)和血清5型(B種)毒株的特異性和純凈性鑒定。通過PCR方法與酶切方法對(duì)Hexon基因全長進(jìn)行鑒定，從而鑒定某一毒株內(nèi)是否存在同種不同血清型污染。將1.3中各毒株Hexon基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，再使用不同的限制性內(nèi)切酶將C、D、E種內(nèi)不同血清型進(jìn)行分型(表4)。選取Acc65Ⅰ分型C4與C10，選取HpaⅠ與BsaBⅠ分型D2、D3、D9、D11，選取AlwNⅠ和SacⅡ分型E6、E7、E8a、E8b。酶切體系為：膠回收產(chǎn)物20 μL，限制性內(nèi)切酶1 μL，10×NEB Buffer 5 μL，H2O 24 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因Hexon的PCR擴(kuò)增 利用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Hexon基因和Fiber基因種特異性引物(表2、表3)對(duì)12個(gè)血清型FAdV毒株的Hexon和Fiber基因ORF全長進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到與預(yù)期目的片段大小一致的基因片段，陰性對(duì)照無特異性擴(kuò)增，結(jié)果見圖1和圖2。而用Fiber其他種的引物擴(kuò)增各毒株，結(jié)果均為陰性，證明各毒株無其他種病毒污染，且表3中的Fiber引物具有種特異性。

M: DL5000 DNA Marker; 1: A1-Hexon; 2: B5-Hexon; 3: C4-Hexon; 4: C10-Hexon; 5: D2-Hexon; 6: D3-Hexon;7: D9-Hexon; 8: D11-Hexon; 9: E6-Hexon; 10: E7-Hexon; 11: E8a-Hexon; 12: E8b-Hexon; 13: Negative control

M: DL5000 DNA Marker; 1: A1- Fiber1; 2: A1- Fiber2; 3: D2- Fiber; 4: D3- Fiber;5: C4- Fiber1; 6: C4- Fiber2; 7: B5- Fiber; 8: E6- Fiber; 9: E7- Fiber; 10: E8a- Fiber;11: E8b- Fiber; 12: D9- Fiber; 13: C10- Fiber1; 14: 10- Fiber2; 15: D11- Fiber

2.2 不同種毒株Fiber的遺傳進(jìn)化分析Fiber(Fiber2)基因ORF全長的核苷酸序列分析(圖3、圖4)顯示，A1、D2、D3、D11、E8a、E8b 六個(gè)毒株與相應(yīng)參考毒株的同源性高達(dá)100%，E6、E7、D9三個(gè)毒株與相應(yīng)參考毒株的同源性達(dá)99.9%，C4毒株與相應(yīng)參考毒株的同源性為99.3%，B5毒株與相應(yīng)參考毒株的同源性為95.8%，C10毒株與相應(yīng)參考毒株的同源性為99.1%。同時(shí)，同種毒株間C4和C10同源性高，為96.9%，D3和D11同源性最低，為72.5%。而不同種毒株間表現(xiàn)為較低的同源性，其中A1與E7、E8a、E8b之間同源性最低，為4.9%。根據(jù)Fiber引物的特異性擴(kuò)增結(jié)果，可對(duì)A1和B5型的毒株進(jìn)行分型鑒定。

圖3 FAdV 不同血清型毒株Fiber基因遺傳進(jìn)化分析

圖4 FAdV 不同血清型毒株Fiber基因同源性比較

2.3 不同種毒株Hexon基因的遺傳進(jìn)化分析 將Hexon基因ORF全長的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并用DNA STAR軟件進(jìn)行分析(圖5、圖6)。結(jié)果顯示，C10、D2、D3、D11、E8a、E8b 六個(gè)毒株與FAdV參考毒株的同源性高達(dá)100%，其余毒株與參考毒株之間的同源性在99.1%到99.9%之間。B5與參考毒株340株的同源性相對(duì)較低，為77.3%。同時(shí)，同一種各毒株間D2和D11同源性最高，為99.1%，D2與D3或D11同源性最低，為80.4%。而不同種毒株間表現(xiàn)為較低的同源性，其中B5與C4同源性最低，為71.4%，與其余血清型毒株的同源性最高為76.6%。

圖5 FAdV 不同血清型毒株Hexon基因遺傳進(jìn)化分析

圖6 FAdV 不同血清型毒株Hexon基因同源性比較

2.4 不同血清型毒株Hexon基因的酶切鑒定分析

2.4.1 FAdV-C種Hexon基因酶切結(jié)果 FAdV-C4-Hexon與FAdV-C10-Hexon的PCR回收使用Acc65Ⅰ酶切后，F(xiàn)AdV-C4-Hexon被切成三段，長度分別為1505 bp、935 bp、700 bp，而FAdV-C10-Hexon被切成兩段，長度分別為2439 bp和700 bp，與預(yù)期片段大小相符，酶切圖譜見圖7。

M: DNA Marker 2000; 1: FAdV-C4-Hexon Acc65Ⅰ酶切片段; 2: FAdV-C10-Hexon Acc65Ⅰ酶切片段

2.4.2 FAdV-D種Hexon基因酶切結(jié)果 FAdV-D2-Hexon、FAdV-D3-Hexon、FAdV-D9-Hexon、FAdV-D11-Hexon使用HpaⅠ酶切后，F(xiàn)AdV-D3-Hexon未被切開，F(xiàn)AdV-D9-Hexon 切為1159 bp和2136 bp兩條帶，F(xiàn)AdV-D2-Hexon、FAdV-D11-Hexon被切成2331 bp、500 bp和400 bp三條帶。再將FAdV-D2-Hexon和FAdV-D11-Hexon使用BsaB Ⅰ酶切，F(xiàn)AdV-D2-Hexon未被切開而FAdV-D11-Hexon被切成2717 bp和571 bp，與預(yù)期片段大小相符。酶切圖譜見圖8。

M: DNA Marker 5000; 1: FAdV-D2 HpaⅠ酶切片段; 2: FAdV-D3 HpaⅠ酶切片段; 3: FAdV-D9 HpaⅠ酶切片段; 4: FAdV-D11 HpaⅠ酶切片段; 5: FAdV-D2 BsaBⅠ酶切片段; 6: FAdV-D11 BsaBⅠ酶切片段

2.4.3 FAdV-E種Hexon基因酶切結(jié)果 FAdV-E6-Hexon、FAdV-E7-Hexon、FAdV-E8a-Hexon、FAdV-E8b-Hexon使用AlwN Ⅰ酶切后FAdV-E6-Hexon 未被切開，F(xiàn)AdV-E8b-Hexon 切為2162 bp和1024 bp兩條帶，F(xiàn)AdV-E7-Hexon、FAdV-E8a-Hexon被切成1232 bp、1021 bp和932 bp三條帶。再將FAdV-E7-Hexon和FAdV-E8a-Hexon使用SacⅡ酶切后， FAdV-E7-Hexon被切為273 bp和2918 bp兩條帶，而FAdV-E8a-Hexon則被切成2368 bp、547 bp和277 bp三條帶，與預(yù)期片段大小相符。酶切圖譜見圖9。

M: DNA Marker 5000; 1: FAdV-E6 AlwNⅠ酶切片段; 2: FAdV-E7 AlwNⅠ酶切片段;3: FAdV-E8a AlwNⅠ酶切片段; 4: FAdV-E8b AlwNⅠ酶切片段;5: FAdV-E7 SacⅡ酶切片段; 6: FAdV-E8a SacⅡ酶切片段

3 討論與結(jié)論

病毒分離鑒定、PCR及測(cè)序分析、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)等病原學(xué)和血清學(xué)方法是FAdV鑒定及感染診斷的常用方法[1,12]。相關(guān)方法的建立和驗(yàn)證等需要背景清楚且純凈的FAdV相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)毒株、核酸及特異性血清，其中標(biāo)準(zhǔn)毒株是基礎(chǔ)。Hexon蛋白作為禽腺病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有種及血清型特異性抗原決定簇，也與致病性密切相關(guān)。同時(shí)，在病毒感染中Fiber最先與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，且具有較好的免疫原性，所以常被用于亞單位疫苗和檢測(cè)試劑盒的研究[13]。FAdV的種與血清型的對(duì)應(yīng)關(guān)系中，A種對(duì)應(yīng)血清1型，B種對(duì)應(yīng)血清5型，C種對(duì)應(yīng)血清4、10型，D種對(duì)應(yīng)血清2、3、9、11型，E種對(duì)應(yīng)血清6、7、8a、8b型。有關(guān)種與血清型對(duì)應(yīng)關(guān)系的分子生物學(xué)分析方法，有關(guān)學(xué)者已進(jìn)行了多種嘗試，獲得了非常有意義的參考依據(jù)[14]。相比Hexon基因，F(xiàn)iber基因在不同基因型毒株之間保守性更低，而在不同基因型內(nèi)不同血清型間保守性相對(duì)較高，因此，用于分型鑒定研究更具參考價(jià)值。本研究首次設(shè)計(jì)了針對(duì)5個(gè)種的Fiber基因鑒定引物，通過對(duì)12個(gè)血清型毒株Fiber基因全長序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，來區(qū)分不同種的FAdV，證明了毒株種的特異性，且各毒株不存在種間交叉。進(jìn)一步對(duì)12個(gè)毒株Hexon基因和Fiber基因測(cè)序結(jié)果的遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明菌種庫引進(jìn)的毒株中B5與B種參考毒株340株之間同源性為95.8%，其余11個(gè)毒株與對(duì)應(yīng)參考毒株Fiber同源性在99.1%至100%之間。由于GeneBank中未見B種TR22毒株相應(yīng)的基因參考序列，目前菌種庫中標(biāo)注的TR22毒株Fiber序列與340毒株序列同源性為95.8%，與其它種的同源性僅為25.8%至56.6%，初步判定其為B種FAdV。而Hexon基因的分析結(jié)果表明，B5與參考毒株340株的同源性為77.3%，其余11個(gè)毒株與對(duì)應(yīng)參考毒株Hexon基因同源性在99.1%至100%之間，進(jìn)一步證明我所保存的毒株標(biāo)注名稱與參考毒株名稱一致。

為確定毒株中是否污染同一種的其他血清型毒株，用酶切法對(duì)C、D、E種毒株的純凈性進(jìn)行鑒定。根據(jù)不同血清型Hexon基因序列中酶切位點(diǎn)所在位置的差異，選取Acc65 Ⅰ、HpaⅠ、BsaB Ⅰ、AlwN Ⅰ、SacⅡ五種限制性內(nèi)切酶，可以將C、D、E種的10個(gè)血清型毒株切為不同大小的片段樣態(tài)，以此來實(shí)現(xiàn)對(duì)不同毒株的的區(qū)分和鑒定。通過酶切產(chǎn)物片段的大小可知，各毒株均未污染本種中其他血清型的毒株，純凈性良好。與之前研究中只用Hexon基因進(jìn)行分型的方法相比[1]，遺傳進(jìn)化分析結(jié)合酶切法對(duì)FAdV 12個(gè)血清型毒株的Hexon基因和Fiber基因進(jìn)行系統(tǒng)特異性和純凈性分析更為準(zhǔn)確。

本研究表明，我國獸醫(yī)微生物菌種保存中心保存的FAdV 12個(gè)血清型毒株純凈性好，且與國際參考毒株一致，遺傳背景清晰可靠，為相應(yīng)特異性血清制備、疫苗研發(fā)和相關(guān)檢驗(yàn)診斷方法的建立提供了重要菌種資源。