黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病病原鑒定及生物學特性研究

劉行風 劉 東 陶 磊 潘春清 李雪蓮 馬 天 潘夢佳 張艷菊

（東北農業(yè)大學農學院，黑龍江哈爾濱 150030）

鏈格孢（Alternaria）在分類上屬于半知菌絲孢綱絲孢目暗色菌科，是重要的植物病原真菌，寄主范圍和地理分布廣，不僅能夠侵染農作物、水果和蔬菜，對全球農業(yè)生產造成嚴重威脅，還可引起人類和動物的許多疾病（孫霞，2006）。鏈格孢在其侵染過程中，可產生70 余種毒素及次生代謝產物，在農作物中?？蓹z測出交鏈孢酚（AOH）、交鏈孢酚單甲醚（AME）、細交鏈孢菌酮酸（TeA）、騰毒素（TEN）等毒素。這些毒素具有致畸性、致死性、致癌性、致突變性、細胞毒性、急性毒性和胚胎毒性，對人類的潛在危害也非常大（郭詩曼和馮啟，2020）。

鏈格孢屬真菌種類繁多，寄主廣泛。目前已發(fā)現(xiàn)的鏈格孢菌有近500 種，依據(jù)寄主的數(shù)目，鏈格孢屬位于近2 000 種真菌屬中的第10 位（Farr et al.，1990；孫霞，2006）。茄鏈格孢（A.solani）和蕓薹鏈格孢（A.brassicae）是世界性分布的種（Rotem，1997），引起茄科蔬菜早疫病和十字花科蔬菜黑斑?。ㄔ茣悦?等，2015；馮中紅和孫廣宇，2020；王燕榮 等，2021）。在葫蘆科蔬菜上，由鏈格孢屬引起的病害通常稱為鏈格孢葉斑病，又稱葉枯病，甜瓜、西葫蘆、南瓜、黃瓜等瓜類作物均可感染（王瑩瑩，2016）。近年來我國葫蘆科蔬菜栽培面積不斷擴大、品種增多并不斷更替，導致葫蘆科蔬菜鏈格孢葉斑病危害加重。賈菊生和李新輝（2002）對新疆瓜類由鏈格孢侵染所致的兩類葉斑病病原進行了研究，結果將新疆瓜類作物上Alternaria引起的葉斑病分為2 個組群，一組是在哈密瓜和西瓜上表現(xiàn)的黑斑病類型，病原為A.cucumerina；另一組是在黃瓜上表現(xiàn)的褐斑病類型，由A.cucurbitae引起。楊克澤等（2009）對甘肅省武威市南瓜葉枯病進行鑒定，認為是由瓜鏈格孢A.cucumerina侵染引起的；除南瓜外，也有研究表明A.cucumerina可以侵染黃瓜，他們對黃瓜抗病種質資源進行了研究，并應用轉錄組學分析了黃瓜應答黑斑病菌脅迫的機理及抗病候選基因（李淑菊 等，2012；王惠哲 等，2016；劉東 等，2017；Sa et al.，2020）。王瑩瑩（2016）對北京、河北、河南、甘肅、遼寧、黑龍江、湖南、湖北等12 個省市9 種葫蘆科蔬菜上發(fā)生的鏈格孢葉斑病進行鑒定，鑒定出交鏈格孢（A.alternata）、西葫蘆生鏈格孢（A.ponicola）和瓜鏈格孢（A.cucumerina），其中在甘肅省酒泉市和山東省壽光市黃瓜上采集的病菌為A.alternata。由此可見，A.cucurbitae、A.alternata和A.cucumerina均可侵染黃瓜。

2019 年東北農業(yè)大學農學院黃瓜課題組在黑龍江省黃瓜病害調查時發(fā)現(xiàn)了鏈格孢侵染疑似病株，為明確黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病病原種類，采集了病樣進行病原鑒定，并對病原生物學特性進行了研究，以期為黑龍江省黃瓜病害綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病病原鑒定

1.1.1 田間癥狀調查及病樣采集 2019 年6 月在黑龍江省齊齊哈爾市大民村采集疑似病樣，記錄癥狀并帶回實驗室進一步分離、鑒定。

1.1.2 病原菌分離、純化 采用組織分離法對病原菌進行分離、純化。取病健交界處組織，切成3～4 mm 正方小塊，經75%酒精表面消毒及0.1%升汞消毒后，用無菌水清洗3 次，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)。菌落長出后進行單孢分離純化（張笛 等，2020）。

1.1.3 致病性測定 將純化的菌株接種到PDB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，130 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d 后，用滅菌雙層紗布過濾，離心后，用無菌水配制成濃度為1 × 107個·mL-1的孢子懸浮液。

黃瓜自交系D1801 用于病菌致病性測定。黃瓜種子由東北農業(yè)大學黃瓜課題組提供。供試黃瓜種子經5%次氯酸鈉溶液消毒10 min，用清水沖洗，放入墊有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中，于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃催芽。待胚根長至0.5 cm 左右時，播種于裝有滅菌蛭石的塑料育苗缽內，每缽播1 粒，26 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)。待黃瓜第1 片真葉展平，采用噴霧接種法苗期接種。接種后保濕24 h，置于26℃/18 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)。接種后10 d 調查發(fā)病情況（劉東 等，2017）。根據(jù)柯赫氏法則，對發(fā)病葉片進行再分離，顯微鏡觀察確定分離病菌與原接種菌是否一致（張艷菊 等，2014）。

1.1.4 病原菌形態(tài)學觀察 將分離純化的菌株接種到PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)6 d，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色。通過光學顯微鏡觀察分生孢子梗及分生孢子的形態(tài)、大小、顏色，測量分生孢子大小。

1.1.5 病原菌分子生物學鑒定 采用SDS 法提取病原菌的基因組DNA（趙春梅和郭晶，2019）。用移菌鉤將培養(yǎng)基表面菌絲刮下，放入經液氮預冷的離心管中，加液氮迅速研磨；向離心管中加入400 μL TE 和80 μL SDS，搖晃混勻；65 ℃水浴30 min，每10 min 顛倒1 次；向離心管中加入100 μL KAc（5 mol·L-1），搖晃6 s，上下顛倒幾次，冰浴30 min；向離心管中加入500 μL 氯仿-異戊醇（氯仿∶異戊醇為24∶1），13 000 r·min-1離心10 min，抽提2 次；離心后取上清液到1 個新的離心管中，加入等體積預冷的異丙醇，沉降30 min；13 000 r·min-1離心10 min，棄上清液。加入1 000 μL 70%酒精吹洗沉淀，13 000 r·min-1離心5 min，重復此步驟2 次。棄上清液，室溫晾置5～10 min，加入50 μL TE 溶解DNA。

采用真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和抗原相關蛋白基因引物Alt a 1-F（5′-ATGCAGTTCACC ACCATCGC-3′）、Alt a 1-R（5′-ACGAGGGTGAYG TAGGCGTC-3′）（Miguel et al.，2010），對病原菌基因組DNA 進行PCR 擴增。引物由哈爾濱擎科生物科技有限公司合成。PCR 反應體系（20 μL）：2× PCR Master mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR 產物委托哈爾濱擎科生物科技有限公司進行測序。測得的DNA序列同基因組GenBank 中公布序列進行同源性比對。

1.2 黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病菌生物學特性研究

供試菌株為采集自齊齊哈爾1.1 中分離鑒定的病菌。

1.2.1 培養(yǎng)基對病菌菌絲生長及產孢量的影響 制備胡蘿卜煎汁培養(yǎng)基（CA）、胡蘿卜馬鈴薯煎汁培養(yǎng)基（PCA）、白菜煎汁培養(yǎng)基（CCA）、白菜馬鈴薯煎汁培養(yǎng)基（PCCA）（張俊華 等，2018）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、黃瓜煎汁培養(yǎng)基、黃瓜馬鈴薯煎汁培養(yǎng)基（吳橋，2017）。將菌株活化并打取直徑0.75 cm 的菌碟，移至不同培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)6 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理5 次重復。待菌落長滿培養(yǎng)皿后，用10 mL 無菌水洗下菌落表面孢子，制成孢子懸浮液，采用血球計數(shù)法測定孢子濃度，每個處理5 次重復。

1.2.2 營養(yǎng)因子對病菌菌絲生長及產孢量的影響以查氏培養(yǎng)基（Czapek）為基礎培養(yǎng)基（王雪 等，2019），將其中的碳源依次等量替換為葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉及甘露醇，并設缺碳對照，研究不同碳源對病菌菌絲生長及產孢量的影響。將氮源依次等量替換為磷酸氫二銨、甘氨酸、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鈉，并設缺氮對照，研究不同氮源對病菌菌絲生長及產孢量的影響。將菌株活化并打取直徑0.75 cm 的菌碟，移至不同培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，菌落直徑和產孢量的測定方法同1.2.1，每個處理5 次重復。

1.2.3 溫度對病菌菌絲生長及產孢量的影響 將直徑0.75 cm 的菌碟接種到PDA 平板上，依次在20、25、28、30、35、40 ℃培養(yǎng)箱中恒溫黑暗培養(yǎng)，菌落直徑和產孢量的測定方法同1.2.1，每個處理5次重復。

1.2.4 光照對病菌菌絲生長及產孢量的影響 將直徑0.75 cm 的菌碟接種到PDA 平板上，依次放置在黑暗、光照、12 h 光照/12 h 黑暗培養(yǎng)箱內，28 ℃恒溫培養(yǎng)，菌落直徑和產孢量的測定方法同1.2.1，每個處理5 次重復。

1.2.5 pH 對病菌菌絲生長及產孢量的影響 將直徑0.75 cm 的菌碟接種到不同pH 值（4、5、6、7、8、9、10、11、12）的PDA 平板上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，菌落直徑和產孢量的測定方法同1.2.1，每個處理5次重復。

1.2.6 病菌致死溫度的測定 將直徑0.75 cm 的菌碟裝入2.0 mL 離心管內，分別放入40、45、50、55、60 ℃恒溫水浴鍋中分別水浴5、10、15 min。水浴后，依次接種到PDA 平板上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)6 d，每個處理5 次重復，觀察菌株是否生長，確定菌株的致死溫度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析，采用LSD 法對各組間數(shù)據(jù)進行差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 黃瓜鏈格孢葉斑病病原的分離與鑒定

2.1.1 田間癥狀調查 田間黃瓜鏈格孢葉斑病疑似病樣主要危害黃瓜葉片，葉片正面和背面均可受害，病斑圓形或不規(guī)則形，4～5 mm，黃褐色至棕褐色，病斑周圍有褪綠暈圈，發(fā)病嚴重時病斑連片，葉肉組織枯死，葉片似火烤狀但不脫落（圖1）。

圖1 黃瓜鏈格孢葉斑病田間癥狀

2.1.2 致病性測定 分離得到的菌株于黃瓜第1片真葉展開時噴霧接種，7 d 后葉片出現(xiàn)褪綠斑，之后病斑連片，葉肉組織壞死；葉柄及莖部病斑初期水漬狀，后變褐色，發(fā)病嚴重時葉片枯死（圖2）。對接種發(fā)病的黃瓜組織再次分離，得到相同的病原菌。

圖2 人工接種黃瓜鏈格孢葉斑病菌后植株發(fā)病癥狀

2.1.3 病原菌形態(tài)特征 病原菌在PDA 平板上培養(yǎng)，菌落初為白色，質地致密，之后菌落中心顏色逐漸加深呈棕黑色，菌落背面外緣白色，中間為棕黑色至純黑色（圖3-a、3-b）。分生孢子梗多分枝（圖3-c）。分生孢子單生或串生，倒梨形、倒棍棒形、卵形或近橢圓形，淡褐色至褐色，有2～8 個橫隔，0～4 個縱隔，有的有1～3 個斜隔膜，有的孢子呈網狀分隔，孢子長8.0～62.0 μm，寬4.0～19.0 μm，有的孢子有2.0～20.0 μm 假喙，圓柱狀，部分孢子的假喙有分枝（圖3-d、3-e）。

圖3 黃瓜鏈格孢葉斑病菌形態(tài)

2.1.4 病原菌分子鑒定 采用rDNA ITS 和抗原相關蛋白Alt a 1 兩對引物對病菌基因組DNA 進行PCR 擴增和測序，分別得到523 bp 和486 bp的條帶（圖4）。將測序所得序列進行BLAST 同源性比對，兩序列結果均顯示該病原菌與交鏈格孢Alternaria alternata的同源性達99%以上，結合病原菌的形態(tài)學鑒定結果，確定引起黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病的病原菌為交鏈格孢Alternaria alternata。

圖4 菌株rDNAITS（上）、Alta1 序列（下）的PCR 擴增結果

2.2 黃瓜鏈格孢葉斑病菌生物學特性

2.2.1 培養(yǎng)基對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響 菌株在CA 培養(yǎng)基和黃瓜煎汁培養(yǎng)基上菌絲生長較快，菌絲生長速度顯著快于在PCCA、PSA、CCA、PDA 和PCA 培養(yǎng)基上的生長，在PCA 培養(yǎng)基上生長速度最慢（圖5）。在PDA 和CA 培養(yǎng)基上病菌產孢量較高，其次為黃瓜煎汁培養(yǎng)基，CCA、PCA、PSA 和黃瓜馬鈴薯煎汁培養(yǎng)基上產孢較少，在PCCA 上未見產孢（圖5）。

圖5 培養(yǎng)基對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響

2.2.2 碳源對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響 當碳源為葡萄糖或蔗糖時，菌落直徑最大，顯著高于其他碳源處理。當碳源為果糖時病菌菌絲生長最慢。從產孢能力來看，葡萄糖最適合病菌產孢，產孢量最高，為1.56 × 106個·mL-1，顯著高于其他碳源處理。產孢量的大小依次為：葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞甘露醇＞可溶性淀粉＞果糖和缺碳對照（圖6）。

圖6 碳源對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響

2.2.3 氮源對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響 相較于其他4 種氮源處理，蛋白胨處理的菌落直徑最大，顯著高于其他氮源處理。其次是酵母浸粉、甘氨酸和硝酸鈉，磷酸氫二銨的效果最差。從產孢量來看，和菌絲生長的變化趨勢基本一致，蛋白胨處理的產孢量最高，為7.31 × 105個 ·mL-1，產孢量大小依次為蛋白胨＞酵母浸粉＞甘氨酸＞硝酸鈉＞磷酸氫二銨＞缺氮對照（圖7）。

圖7 氮源對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響

2.2.4 溫度對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響 從圖8 中可以看出，28 ℃時菌落直徑最大，與其他處理具有顯著差異，其次為25、20℃和30 ℃，35 ℃和40 ℃時菌落直徑增長極其緩慢，已經非常不適合菌株生長。從產孢量來看，28℃時菌株產孢量最大，顯著高于其他處理；25 ℃次之；30 ℃處理雖然比20 ℃處理的菌絲生長速率慢，但產孢量顯著高于20 ℃處理；40 ℃時產孢量最低。

圖8 溫度對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響

2.2.5 光照對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響 不同光照處理下菌絲生長情況基本一致，各處理間差異不顯著。從產孢量來看，光暗交替處理的產孢量最多，為2.08 × 106個·mL-1，顯著高于24 h 黑暗處理（圖9）。

圖9 光照對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響

2.2.6 pH 對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響 菌絲在pH 4～12 時均能生長，但菌絲在pH 為8 和9 時生長速度最快，高于其他pH 處理，pH 為4 和11、12 時生長緩慢；病菌在pH 5～12范圍內能夠產孢，產孢的最適pH 為8～9，顯著高于其他pH 處理（圖10）。

圖10 pH 對黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長及產孢量的影響

2.2.7 病菌致死溫度 病菌在40、45、50 ℃恒溫水浴鍋中加熱5、10、15 min，在28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)6 d，在PDA 培養(yǎng)基上均可生長；55 ℃ 5 min 加熱處理的菌株也可以生長，但55 ℃ 加熱10、15 min 和60 ℃加熱條件下菌株均不能生長。因此，病菌的致死溫度是55 ℃ 10 min。

3 結論與討論

鏈格孢屬（Alternaria）真菌是一類重要的植物病原菌。一直以來，瓜鏈格孢A.cucumerina被認為是引起黃瓜葉斑病的主要病原菌（孫玉河 等，2012）。但賈菊生和李新輝（2002）、王瑩瑩（2016）等研究發(fā)現(xiàn)A.alternata、A.cucurbitae也可以侵染黃瓜引起病害。本文通過對黃瓜鏈格孢疑似病樣的病菌進行形態(tài)及分子生物學鑒定，將黑龍江省齊齊哈爾黃瓜大棚內發(fā)生的葉斑病病原鑒定為A.alternata。

鏈格孢菌種類繁多，我國記載的鏈格孢屬真菌有123 個種及變種（馮中紅和孫廣宇，2020），主要根據(jù)分生孢子形狀、大小、顏色、分隔、喙的特征、成鏈特性、產孢表型對鏈格孢種進行劃分（Neegaard，1945）。雖然根據(jù)形態(tài)可以區(qū)分大部分鏈格孢種，但是營養(yǎng)條件、溫度、光照、pH 等環(huán)境條件極易影響鏈格孢的形態(tài)特性，尤其是對喙短或者無喙的小孢子種，導致種的鑒定更加困難（馮中紅和孫廣宇，2020）。而分子生物學鑒定為鏈格孢種的鑒定提供了有力手段，ITS、ATP、gpd、CAL、actin 等序列已用于區(qū)分鏈格孢屬及其相近屬，尤其Alt a 1 是鏈格孢屬真菌特有序列，在鏈格孢屬真菌尤其是小孢子種中差異性較大，可將77%以上的供試菌株鑒定到種，已逐漸被廣泛應用于鏈格孢種的分類鑒定（Miguel et al.，2010）。因此本文采用菌株ITS 序列和Alt a 1 序列相結合，確定引起黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病的病原為Alternaria alternata。

Alternaria alternata寄主廣泛，可引起木薯白點病、水稻褐變穗病、紫花苜蓿斑點病等病害。盡管已有A.alternata生物學特性的研究，但在不同作物上已有的研究結果并不一致（聶啟軍 等，2016；馬連杰 等，2018；張俊華 等，2018；鄭肖蘭 等，2018；蔡吉苗 等，2019；方婷，2019）。本試驗對黑龍江省采集的A.alternata生物學特性研究表明，菌絲生長最快的培養(yǎng)基是CA 和黃瓜煎汁培養(yǎng)基；最適碳源為葡萄糖和蔗糖，氮源為蛋白胨；最適培養(yǎng)條件為28 ℃，pH 8～9；致死溫度為55 ℃ 10 min；光照對菌絲生長的影響不大。最適合病菌產孢的培養(yǎng)基為PDA 和CA 培養(yǎng)基，最適碳源和氮源分別為葡萄糖和蛋白胨，培養(yǎng)條件為28 ℃、pH 8～9、12 h 光照/12 h 黑暗時產孢量最大。

黃瓜鏈格孢葉斑病為氣傳病害，病菌在病殘體及種子上越冬成為翌年初侵染源。種子帶菌是病害遠距離傳播的重要途徑，也是常發(fā)區(qū)初侵染源之一。本試驗結果表明，Alternaria alternata的致死溫度是55 ℃ 10 min，可以利用這一特性，在播種前對黃瓜種子進行溫湯處理，對于未發(fā)生地區(qū)可以從源頭上杜絕病害的發(fā)生，常發(fā)區(qū)也可以減輕由種子帶菌所造成的損失。在黃瓜的保護地生產中，農民通常會采用高溫悶棚的方法來防治黃瓜霜霉病等病害。高溫悶棚的最佳溫度是45 ℃，低于42 ℃效果不好，高于48 ℃植物生長會受害（楊海燕 等，2019）。而本試驗結果顯示，黃瓜鏈格孢葉斑病菌的最適培養(yǎng)條件為28 ℃，35 ℃及40 ℃時雖然病菌生長受到抑制，但尚可存活，只有在55 ℃以上時才完全不能生長。因此在生產中如果采用高溫悶棚的方法，雖然可以使病菌生長受到抑制，但不能完全致死，一旦環(huán)境條件適合還會繼續(xù)危害。

Alternaria alternata菌絲生長和產孢最適的pH為8～9，即在弱堿性條件下菌絲生長較快，產孢量大。pH 5～7 時即中性偏酸條件下，菌絲生長較緩慢，尤其是產孢量顯著降低。根據(jù)這一特性，在有黃瓜鏈格孢葉斑病發(fā)病的田塊，可盡量選擇弱酸性的葉面肥以及農藥，以達到更好的防治效果。

本試驗明確了黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病菌生長與環(huán)境條件的關系，對于病害綜合防治具有重要意義。