芪葛湯有效成分降脂的體外初篩實驗

張偉嬌， 譚梅傲， 柯雪紅， 周遵明， 黃可兒

（1.深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東深圳518000；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405；3.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州510405；4.嶺南醫(yī)學研究中心，廣東廣州510405）

芪葛湯是由黃芪30 g、葛根10 g、陳皮5 g組成。方中：黃芪，甘，微溫，入脾、肺經(jīng)，具有健脾補中的功效；葛根，甘、辛，涼，歸脾、胃經(jīng)，具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉的功能；陳皮，苦，溫，歸脾、肺經(jīng)，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效。本課題組多年致力于芪葛湯的藥理研究，芪葛湯對大鼠酒精性肝損傷具有治療作用，芪葛湯預給藥不僅能降低酒精性肝損傷大鼠的谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST），通過代謝組學分析亦發(fā)現(xiàn)其還能改善酒精性肝損傷的甘油磷脂、色氨酸、花生四烯酸等脂質產物的代謝[1]，表明芪葛湯可能具有降脂的藥理作用。

在前期實驗中，本課題組共篩選了多個芪葛湯的入血移行成分[2]，包括川陳皮素、3’-羥基葛根素等，而黃芪甲苷、葛根素為黃芪、葛根的主要成分，因此，本研究共篩選黃芪甲苷（astragalosideⅣ，AS-Ⅳ）、葛根素（puerarin）、川陳皮素（nobiletin）、3’-羥基葛根素（3’-hydroxy puerarin）、毛 蕊 異 黃 酮（calycosin）、柚 皮 素（naringenin）、槲皮素（quercetin）等7個有效成分進行體外的初篩實驗。

由于體內環(huán)境與體外環(huán)境的差異，本實驗采用300 μmol/L油酸+150 μmol/L棕櫚酸+100 μmol/L亞油酸構建大鼠肝細胞脂質堆積的模型，應用全自動生化儀檢測大鼠肝細胞的甘油三酯（TG）含量并應用油紅O染色法觀察肝細胞脂質堆積情況，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 細胞大鼠BRL肝細胞系購自于國家實驗細胞資源共享平臺，培養(yǎng)條件：DMEM高糖培養(yǎng)基＋10%胎牛血清（FBS）＋1%青霉素-鏈霉素；凍存條件：DMEM高糖培養(yǎng)+8%二甲基亞砜（DMSO）+20%FBS。

1.2 藥品黃芪甲苷分析標準品[高效液相色譜（HPLC）≥99.89%]、川 陳 皮 素 分 析 標 準 品（HPLC≥98.5%）、毛蕊異黃酮分析標準品（HPLC≥98.5%）、柚皮分析標準品（HPLC≥99.18%）（成都曼思特生物科技有限公司）；葛根素分析標準品（HPLC≥98%）（上海源葉公司）；3’-羥基葛根分析標準品（HPLC≥98%）[Cato research chemical（中國）公司]；槲皮素分析標準品（中科院藥檢所）。

1.3 試劑與儀器亞油酸（西安鯤創(chuàng)公司）；油酸鈉、棕櫚酸鈉（美國Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（0.25%）、青霉素-鏈霉素美國Gibco公司）；TG檢測試劑盒（九強生物技術有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）細胞增殖及毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；油紅O染色液（北京Solarbio公司）。CKS53倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；BS-220全自動生化儀（美國邁瑞公司）；BIORAD550酶標儀（日本Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 棕櫚酸與油酸的配制由于棕櫚酸與油酸均不溶于水，故采用牛血清蛋白（BSA）配制6 mmol/L棕櫚酸與12 mmol/L油酸。具體操作方法：使用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制3 mL 20% BSA與40%BSA。稱取21.92 mg油酸鈉與10.02 mg棕櫚酸鈉，分別加入3 mL PBS，75℃恒溫水浴箱加熱溶解油酸鈉與棕櫚酸鈉。將油酸鈉快速加入到20% BSA中，棕櫚酸鈉加入到40%BSA中。

2.2 大鼠肝細胞脂質堆積體外模型的構建將BRL細胞分為正常對照組、模型組。其中：正常對照組不處理，模型組加入300 μmol/L油酸+150 μmol/L棕櫚酸+100 μmol/L亞油酸誘導24 h構建大鼠肝細胞脂質堆積體外模型。

2.3 有效成分的配制使用DMSO配制100 mmol/L黃芪甲苷、40 mmol/L川陳皮素、500 mmol/L 3’-羥基葛根素、500 mmol/L毛蕊異黃酮、500 mmol/L柚皮素、100 mmol/L槲皮素儲存液。葛根素臨用前DMEM配制5 mmol/L葛根素。

2.4 應用MTT實驗篩選各有效成分無毒性的濃度

2.4.1 MTT實驗分組①黃芪甲苷：設置空白對照組，DMEM組，DMSO溶劑組，100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 μmol/L黃芪甲苷溶液組。②葛根素：由于葛根素在水溶液中溶解度相對較高，可不利用DMSO助溶，故設置空白對照組，DMEM組，5 000、2 500、1 000、500、250、100、50、25 μmol/L葛根素組。③川陳皮素：設置空白對照組，DMEM組，DMSO溶劑組，40、20、10 μmol/L川陳皮素組。④3’-羥基葛根素：設置空白對照組，DMEM組，DMSO溶劑組，500、250、125、75、37.5、18.75、9.375 μmol/L 3’-羥基葛根素組。⑤毛蕊異黃酮：設置空白對照組，DMEM組，DMSO溶劑組，500、250、125、75、37.5、18.75、9.375 μmol/L毛蕊異黃酮組。⑥柚皮素：設置空白對 照 組，DMEM組，DMSO溶 劑組，500、250、125、75、37.5、18.75、9.375 μmol/L柚皮素組。⑦槲皮素：設置空白對照組，DMEM組，DMSO溶 劑 組，100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 μmol/L槲皮素組。①~⑦除空白對照組無肝細胞，僅加入PBS，其他組別均含肝細胞。每組設置6個復孔。

2.4.2 MTT實驗操作步驟胰酶消化細胞，重懸計數(shù)后，將細胞鋪板在96孔板中，每孔加入2×103個細胞（鋪板數(shù)量取決于細胞增殖速度）。1 d后，待細胞鋪板后，每孔加入相應的藥物干預。待藥物干預24、48 h后，小心的吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTT溶解。37℃孵育4 h左右，吸掉液體，每孔加入150 μL DMSO溶液。振搖10 min后，應用酶標儀于490 nm波長處讀取吸光度值。

2.5 有效成分干預實驗細胞鋪板于6孔板中，根據(jù)MTT結果，選擇適宜劑量干預。中藥單體干預24 h后，小心吸取培養(yǎng)基，棄掉。重新加入相同濃度的單體干預，同時以300 μmol/L油酸+150 μmol/L棕櫚酸+100 μmol/L亞油酸誘導構建肝細胞脂質堆積模型，24 h后，抽提細胞TG、固定行油紅O染色。

2.5.1 細胞TG的抽提與檢測①氯仿與甲醇提?。簽樘崛≈|被廣泛采用的方法。具體操作方法：胰酶消化細胞后，用PBS洗滌細胞2次。加入抽提液（氯仿∶甲醇=2∶1）1 mL，并重懸細胞。超聲裂解細胞10 min。超聲工作效率99%，工作頻率25 kHz。放入4℃抽提24 h。以12 000 r/min（離心半徑5 cm）離心30 min。吸取上清，加入1/5的純水洗滌，并渦旋15 s。以2 000 r/min（離心半徑5 cm）離心10 min，棄上清。低速流量氮吹樣本，以免脂質殘留到管壁。加入200 μL無水乙醇復溶，必要時90℃水浴鍋中復溶。全自動生化儀上機檢測樣本。②異丙醇提?。涸趯嶒炦^程中發(fā)現(xiàn)，氯仿與甲醇的提取需要經(jīng)過多個不同的步驟，步驟過程中對脂質耗損較多，故本實驗直接采用異丙醇提取脂質。具體操作方法：胰酶消化細胞后，將細胞收集到5 mL的離心管中，加入300 μL異丙醇，并重懸細胞。在常溫或者冰水浴中超聲裂解細胞10 min。超聲工作效率99%，工作頻率25 kHz，在鏡下可見細胞破碎。放入4℃抽提24 h。以12 000 r/min（離心半徑5 cm）離心30 min，取上清250 μL。全自動生化儀上機檢測樣本。每組設置6個復孔。

2.5.2 油紅O染色法油紅O是很強的脂溶劑和染脂劑，油紅O染色能使脂質染成橘黃至紅色。具體操作方法：100 mL異丙醇加入0.5 g油紅O固體，配制油紅O儲存液，避光保存，使用前儲存液∶ddH2O=3∶2配制，并經(jīng)微孔濾過膜過濾，使用前現(xiàn)配現(xiàn)用。移除細胞培養(yǎng)基，用PBS洗去多余的培養(yǎng)基，加多聚甲醛固定液固定30 min。棄去固定液，水洗2次。60%異丙醇浸洗5 min。棄去異丙醇，加入新配制好的油紅O染液，浸染15 min，水洗2~5次。加入Mayer蘇木素染色液，復染核1 min，棄去并水洗2~5次。加入分化液1 min，鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料滿足正態(tài)分布，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示；如不滿足正態(tài)分布，則用M（P25～P75）表示。同時滿足正態(tài)性和方差齊性的2組獨立計量資料可用兩獨立樣本t檢驗，否則采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 肝細胞脂質堆積體外模型的構建肝細胞與300 μmol/L油酸+150 μmol/L棕櫚酸+100 μmol/L亞油酸共培養(yǎng)24 h后，經(jīng)油紅O染色，細胞內可見明顯的紅色脂質，經(jīng)氯仿＋甲醇抽提細胞脂質后，應用全自動生化儀檢測細胞TG含量，結果顯示，TG含量明顯升高（P<0.05），證明脂肪酸可成功誘導肝細胞脂質堆積模型。見圖1。

圖1 肝細胞脂質堆積體外模型的構建Figure 1 Construction of lipid accumulation model of live cells in vitro

3.2 芪葛湯有效成分的MTT實驗結果篩選芪葛湯有效降脂成分，首先需要了解芪葛湯有效成分對肝細胞的毒性劑量。故采用MTT實驗觀察各有效成分對肝細胞增殖情況的影響，結果發(fā)現(xiàn)，各濃度黃芪甲苷、葛根素、川陳皮素24、48 h均對肝細胞無明顯增殖及毒性作用。見圖2。

圖2 黃芪甲苷、葛根素、川陳皮素的MTT實驗Figure 2 MTT assay results of astragalosideⅣ，puerarin and nobiletin

500、250、125 μmol/L 3’-羥基葛根素24 h對細胞有增殖作用，48 h則無明顯毒性及增殖作用。500、250、125 μmol/L毛蕊異黃酮24、48 h均對細胞有毒性作用。各濃度柚皮素24 h對細胞無毒性作用，500、250、125 μmol/L柚皮素48 h對細胞有毒性作用。見圖3。

圖3 3’-羥基葛根素、毛蕊異黃酮、柚皮素的MTT實驗結果Figure 3 MTT assay results of 3’-hydroxypuerarin，calycosin and naringenin

100 μmol/L槲皮素24 h對細胞有毒性作用。100、50、25 μmol/L槲皮素48 h均對細胞有毒性作用。見圖4。

圖4 槲皮素的MTT實驗結果Figure 4 MTT assay results of quercetin

3.3 TG含量的測定結果（氯仿與甲醇抽提）經(jīng)有效成分干預后，根據(jù)MTT結果，選擇各有效成分無毒性的濃度進行干預實驗。以100 μmol/L黃芪甲苷、1 mmol/L葛根素、40 μmol/L川陳皮 素、500 μmol/L 3’-羥基葛根素、100 μmol/L毛蕊異黃酮、100 μmol/L柚皮素、20 μmol/L槲皮素干預細胞，并采用氯仿與甲醇抽提細胞脂質，具體結果見表1。

表1 芪葛湯有效成分干預對模型細胞TG含量的影響（氯仿與甲醇抽提脂質）Table 1 Effects of intervention of effective components of Qige Decoction on TG content（chloroform and methanol extracting lipid）

經(jīng)正態(tài)性檢驗，各組數(shù)值均符合正態(tài)分布，經(jīng)正態(tài)性檢驗的P值分別為0.318、0.152、0.561、0.430、0.526、0.669、0.740、0.109、0.059，均P>0.05。經(jīng)方差齊性檢驗，各組之間比較均符合方差齊性。2組之間可進行獨立樣本t檢驗。

與正常對照組比較，模型組TG含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、葛根素組、陳皮素組、柚皮素組、槲皮素組TG含量降低（P<0.05或P<0.01），3’-羥基葛根素組、毛蕊異黃酮組TG含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3.4 TG含量的測定結果（異丙醇抽提）由于氯仿與甲醇抽提抽提步驟較多，組間方差較大，為了減少抽提的過程的誤差，采用單純異丙醇抽提細胞中的脂質，具體結果見表2。

表2 芪葛湯有效成分干預對細胞模型TG含量的影響（異丙醇抽提）Table 2 Effects of intervention of effective components of Qige Decoction on TG content（isopropanol extracting lipid）

經(jīng)正態(tài)性檢驗，各組數(shù)值均符合正態(tài)分布，經(jīng)正態(tài)性檢驗的P值分別為0.846 537、0.695 079、0.141 112、0.183 242、0.557 428、0.137 352、0.322 330、0.083 276、0.062 296，均P>0.05。經(jīng)方差齊性檢驗，各組之間比較均符合方差齊性，2組之間可進行獨立樣本t檢驗。

與正常對照組比較，模型組TG含量顯著升高（P<0.001）；與模型組比較，黃芪甲苷組、川陳皮素組、柚皮素組、槲皮素組TG含量下降（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，葛根素組、3’-羥基葛根素組、毛蕊異黃酮組TG含量無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

3.5 油紅O染色結果有效成分干預細胞后，經(jīng)固定后的油紅O染色，結果提示，模型組細胞大量脂質堆積，而黃芪甲苷組、川陳皮素組、柚皮素組的脂質堆積較模型組稍有減少，其他組則較模型組改善不明顯。見圖5。

圖5 芪葛湯有效成分干預后對肝細胞脂質堆積的影響（油紅O染色，×200）Figure 5 Effects of intervention of effective components of Qige Decoction on lipid accumulation of liver cells（by oil red O staining，×200）

4 討論

芪葛湯組方源于黃芪葛根湯（黃芪20 g、葛根10 g）。黃芪葛根湯是常用經(jīng)方，出自《證治匯補》，能解酒郁，能使酒濕內從氣化而消，外從元府而泄，為虛人傷酒惡寒之專方。本課題組前期通過比較黃芪-葛根藥對的不同配比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）干預乙醇所致胃黏膜損傷，結果發(fā)現(xiàn)不同配比的黃芪-葛根均能保護胃黏膜損傷，其可能的機制是通過抑制Bcl-2/Bax/Caspase-3等凋亡相關蛋白的表達，其中，以黃芪∶葛根=3∶1為保護胃黏膜的最佳配比[2]。在對黃芪有效成分的研究中，我們發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷及黃芪甲苷能改善大黃灌胃所誘導的胃黏膜損傷[3]，黃芪甲苷在體內、體外均能保護乙醇誘導的胃黏膜損傷，其可能的機制是通過抑制炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）的表達，促進IL-10的釋放，同時還能降低胃組織凋亡相關蛋白的表達[4-5]。

本課題組基于黃芪-葛根藥對能保護胃黏膜的基礎上，進一步研究了芪葛湯對酒精性肝損傷的防治作用，發(fā)現(xiàn)芪葛湯預給藥能改善酒精性肝損傷大鼠的甘油磷脂、色氨酸、花生四烯酸等脂質產物代謝[1]。在對陳皮的研究中，我們發(fā)現(xiàn)：用廣陳皮水提液干預高脂飼料喂養(yǎng)誘導的高脂血癥大鼠模型，結果顯示廣陳皮能顯著降低高脂血癥大鼠的膽固醇（TC）、TG、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），以及升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。對高脂血癥大鼠的血清與尿液的代謝組學分析還發(fā)現(xiàn)，陳皮干預能顯著回調高脂血癥大鼠1-磷酸鞘氨醇、LysoPC（18∶0）、9-癸酰肉堿、乙酰肉堿，順式-4-辛二酸、2-辛酸和醛酸等多個代謝物水平，這些代謝物涉及甘油脂代謝、脂肪酸合成等多條代謝通路[6-7]。上述前期研究結果提示，芪葛湯可能具有調脂的作用，但是，我們對芪葛湯中的哪些成分具有降脂作用仍不十分明確，因此，本研究進一步篩選了芪葛湯的多個有效成分并進行體外的初篩實驗。

在芪葛湯的體外篩選實驗中，綜合甲醇+氯仿與異丙醇的抽提方法，黃芪甲苷、川陳皮素、柚皮素能降低大鼠肝細胞脂質堆積。黃芪甲苷是黃芪的主要成分，無論是以黃芪為君藥的方劑還是單藥黃芪都已經(jīng)被實驗證明具有降低血脂的療效。有研究表明，黃芪能通過調節(jié)mTORC1-過氧化物酶體增殖劑激活受體γ信號通路，降低TG水平[8]，黃芪的水提物能減少載脂蛋白E（ApoE）基因敲除大鼠動脈硬化斑塊[9]。而黃芪甲苷則被證明能夠濃度依賴性地增強AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）、乙酰輔酶A羧化酶和膽固醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBPs）的磷酸化，抑制成熟SREBP-1的積累和核易位。黃芪甲苷治療還可以濃度依賴性地減輕游離脂肪酸誘導的肝內質網(wǎng)應激以及相關蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78、C/EBP同源蛋白和蛋白激酶R樣內質網(wǎng)激酶的表達。用AMPK抑制劑化合物C（20 μmol/L）預處理的細胞則大大減少了這些有益作用，說明黃芪甲苷可能通過調控AMPK影響肝臟脂質代謝[10-11]。川陳皮素可以有效地抑制高脂膳食大鼠的體質量增長，降低Lee’s指數(shù)、食物利用率和脂肪系數(shù)，降低血清中TC、TG和LDL-C水平，同時，還可降低肝臟指數(shù)、血清中ALT、AST水平，改善肝臟脂肪變性情況[12-13]。柚皮素可降低高脂飼養(yǎng)大鼠的TG水平，還可降低ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊[14]。

而在甲醇+氯仿抽提TG的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)葛根素也能降低TG水平。亦有其他研究結果表明，葛根最主要的成分葛根素能降低高脂血癥大鼠TC、TG、LDL-C水平及全血低、高切黏度，并增加HDL-C的水平[15-16]。葛根素通過AMPKPPARγ-肝X受體α（liver X receptors α，LXR-α）通路顯著促進了ATP結合盒轉運蛋白A1（ABCA1）mRNA和蛋白的表達，降低了人類THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中的細胞脂質蓄積；而向巨噬細胞中轉染miR-7，可降低葛根素處理的巨噬細胞AMPK的磷酸化，下調PPARγ-LXR-α-ABCA1的表達，表明了葛根素可通過涉及miR-7和AMPKPPARγ-LXR-α-ABCA1級聯(lián)的途徑，促進ABCA1介導的脂質外流，并降低細胞內脂質水平[16]。在異丙醇抽提實驗中，我們發(fā)現(xiàn)槲皮素也具有降脂的療效。槲皮素已被大量實驗證明具有降脂作用。槲皮素屬黃酮醇類化合物。在臨床試驗中，年齡在30~60歲的2型糖尿病患者口服槲皮素（250 mg/d）8周可顯著降低血清LDL水平[17]。體外和體內實驗表明，槲皮素能增加肝臟低密度脂蛋白受體的表達[18]。75 μmol/L槲皮素處理HepG2細胞24 h后，SREBP2蛋白水平升高[19]。但是，由于本研究在甲醇＋氯仿、異丙醇的抽提實驗中未同時發(fā)現(xiàn)葛根素與槲皮素的具體降脂作用，故暫不能明確葛根素與槲皮素是否具有降脂的作用。此外，本實驗未發(fā)現(xiàn)3’-羥基葛根素、毛蕊異黃酮具有降脂的作用，故推測3’-羥基葛根素、毛蕊異黃酮可能不是芪葛湯降脂的有效成分。

無論是黃芪甲苷還是葛根素、槲皮素均存在溶解度差、口服利用率低、代謝率高等問題，這些問題均限制了其在體內的應用。目前，對于槲皮素，研究人員已經(jīng)通過化學修飾和納米技術改進提高了槲皮素的生物利用度。研究人員合成了槲皮素醚類衍生物、槲皮素酯類衍生物和槲皮素胺類衍生物，以提高槲皮素的水溶性。如：Kim等[20]將氨基酸與疏水側鏈如丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸結合到槲皮素上，提高槲皮素的水溶性；Sun等[21]構建的槲皮素納米脂質載體使槲皮素的水溶性提高了1 000倍。因此，積極地通過各種技術手段增加單體的口服利用度對進一步研究單體在體內的藥理機制是必要的。

本課題組在篩選出芪葛湯有效成分之后，下一步也將分別在體內、體外研究其降脂的藥理機制。