臺灣香檬果皮川陳皮素分離制備及其抗腫瘤活性研究

谷 樂，劉韶松，何麗娟，沈瑞池，黃珺梅

(1.福建省亞熱帶植物研究所／福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361006；2.廈門華僑亞熱帶植物引種園／廈門市植物引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361002)

臺灣香檬(Citrus depressa)，又名扁實(shí)檸檬，屬蕓香科柑橘屬多年生植物[1]，臺灣四種原生柑橘之一。臺灣香檬香味特殊，病蟲害少，易于栽培管理，果皮中富含川陳皮素，是我國臺灣地區(qū)以及日本非常受歡迎的健康養(yǎng)生作物[2—3]。

川陳皮素(Nobiletin，NOB)又稱蜜橘黃酮、川皮亭等，是從柑桔屬植物果皮中提取的多甲氧基黃酮類化合物[4]。川陳皮素能對人體起抗氧化、抗癌、抗炎等作用，還具備神經(jīng)營養(yǎng)活性，可治療阿爾茨海默癥等神經(jīng)衰退性疾病[5—8]。此外，川陳皮素對于肥胖癥、高血脂、神經(jīng)變性等疾病也有一定的療效，并能有效防止皮膚色素沉著、抗黑色素瘤等[9—10]。川陳皮素在醫(yī)學(xué)和食品中都有較高的應(yīng)用價值，但較高的市場價格限制其廣泛應(yīng)用。川陳皮素主要從柑橘、茶枝柑等果皮中提取分離制備，也可用桔皮素等黃酮物質(zhì)為母本化學(xué)合成，但受制于原材料含量、成本等尚無法大量獲得，限制了川陳皮素的進(jìn)一步藥用和食用研究[11]。因此，本研究在臺灣香檬引種馴化成功的基礎(chǔ)上，以其果皮為原料分離制備川陳皮素，同時通過MTT和流式細(xì)胞儀對川陳皮素的抗腫瘤活性進(jìn)行初步分析，旨在為臺灣香檬的綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臺灣香檬采自廈門市福建省亞熱帶植物研究所，2015年7月自臺灣屏東地區(qū)引種[12]；川陳皮素對照品，阿拉?。籑TT，上海生工；Annexin V雙染試劑盒，Roche；石油醚、甲醇等有機(jī)溶劑，國產(chǎn)分析純試劑；硅膠，青島鼎康；高效液相色譜儀，Waters 2695；倒置顯微鏡，Olympus；細(xì)胞培養(yǎng)箱，博迅；酶標(biāo)儀，Thermo；流式細(xì)胞儀，Beckman。

1.2 方法

1.2.1 色譜檢測條件

色譜柱：Hypersil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長328 nm，流動相甲醇:水=60:40，流速1 mL·min-1，保留時間 15.50 min。

1.2.2 川陳皮素提取

香檬果皮粉末用 10倍體積的 90%甲醇超聲提取10 min。提取三次，提取液減壓濃縮得到浸膏。

1.2.3 川陳皮素分離

硅膠柱分離：取香檬皮浸膏30 g，甲醇溶解后與90 g硅膠拌樣，裝填于減壓層析柱上(400 mm ×90 mm，柱高130 mm，硅膠重300 g)，以不同比例石油醚-乙酸乙酯(10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、0:1)梯度洗脫。

高效制備液相分離：色譜柱SB-C18 PrepHT，5 μm,30 mm×150 mm；流動相甲醇:水=60:40；流速20 mL·min-1；波長 328 nm。

1.2.4 川陳皮素抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 MTT比色法

選擇生長狀態(tài)較好的肝癌HepG2、肺癌A549、宮頸癌 Hela細(xì)胞，對其進(jìn)行消化并得到細(xì)胞懸液，利用血球計數(shù)板計數(shù)。按照每孔100 μL將4000個細(xì)胞接種于96孔板中，每隔24 h每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液10 μL。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，每孔加 100 μL 10% SDS-0.01 mol·L-1HCL 溶解過夜，離心后上清液在波長560 nm測定吸光值。

1.2.4.2 流式細(xì)胞測定法

選取不同濃度川陳皮素(40、80 μmol·L-1)研究對肝癌細(xì)胞 HepG2凋亡的影響。將 HepG2細(xì)胞以8×105個接種于60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜，離心棄上清，加入1 mL 磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再將細(xì)胞放在渦旋儀上逐滴加入3 mL預(yù)冷的95%乙醇，放入 4 ℃過夜。再次離心棄上清，用 400 μL PBS重懸細(xì)胞，加入 4 μL RNase(10 mg·mL-1)，避光 37 ℃作用 30 min，最后加入 20 μL PI(1 mg·mL-1)并于 37 ℃作用30 min，上流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)測定數(shù)據(jù)得到回歸方程y=8.4549x-1.3342，R2=0.9999，表明在實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.2 川陳皮素的分離

硅膠柱分離：取不同比例的石油醚-乙酸乙酯(10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、0:1)的洗脫液進(jìn)行液相檢測，確定川陳皮素幾乎全部集中于石油醚:乙酸乙酯(2:1)洗脫液中。收集此部分洗脫劑，濃縮后用制備液相進(jìn)一步純化。

高效制備液相分離：收集28 min的餾分，濃縮后減壓干燥，獲得川陳皮素高純品(圖1)。

圖1 分離所得川陳皮素液相色譜檢測圖Fig.1 Liquid chromatographic analysis of nobiletin

2.3 臺灣香檬川陳皮素的結(jié)構(gòu)

川陳皮素純品為黃色粉末，1H-NMR(MeOD,400 MHz)δ:7.63(1H,dd,J=8.4/1.6 Hz,H-6'),7.52(1H,J=1.6Hz,H-2'),7.01(1H,dd,J=8.4 Hz,H-5'),6.84 (1H,s,H-3),4.01、3.96、3.86、3.833、3.825、3.77(each 3H,s,OCH3),3.83,3.82(6H,s,OCH3),13C-NMR(MeOD,400 MHz) δ:160.7(C-2),106.7(C-3),176.2(C-4),147.8(C-5),143.9(C-6),151.4(C-7),138.1(C-8),147.6(C-9),114.7(C-10),123.6(C-1'),109.2(C-2'),149.6(C-3'),152.0(C-4'),112.3(C-5'),119.7(C-6'),(62.3,62.2,61.9,61.8,56.1,56.1)6個OCH3。以上數(shù)據(jù)與董發(fā)武等[13]的報道一致，確定化合物為川陳皮素(圖 2)。

圖2 川陳皮素結(jié)構(gòu)式Fig.2 The structural formula of nobiletin in Citrus depressa peel

2.4 臺灣香檬川陳皮素抗腫瘤活性

選取肝癌HepG2、肺癌A549、宮頸癌Hela細(xì)胞，分別設(shè)置 0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1和 40 μmol·L-1等比濃度梯度，利用 MTT方法分析川陳皮素對三種腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。實(shí)驗(yàn)表明川陳皮素對腫瘤細(xì)胞具有一定的廣譜抑制作用，并呈現(xiàn)出濃度依賴性(圖3)。

圖3 不同濃度川陳皮素對3種癌細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effect of different concentrations of nobiletin on proliferation of 3 carcinomas cells

取 40 μmol·L-1、80 μmol·L-1川陳皮素研究其對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響。結(jié)果顯示，川陳皮素能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，40 μmol·L-1濃度作用肝癌細(xì)胞時早期凋亡率由 1.0%上升至 3.5%，晚期凋亡則從1.8%升高到13.6%；川陳皮素濃度增高至80 μmol·L-1時，其早期凋亡率為3.7%，晚期凋亡率為20.7%(圖4)。以上數(shù)據(jù)表明，川陳皮素能影響肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

圖4 不同濃度川陳皮素對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響Fig.4 The effect of different concentrations of nobiletin on apoptosis of liver cancer cells

3 討論

本文通過超聲波方法從臺灣香檬果皮中提取川陳皮素，最終分離制備得到含量為98%的高純川陳皮素樣品。用高效液相色譜進(jìn)行純度分析，并經(jīng)高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。天然產(chǎn)物尤其是植物來源的生物活性化合物因具有更高的生物反應(yīng)性和靶點(diǎn)協(xié)同進(jìn)化性，對正常細(xì)胞毒性較小，已在癌癥化療中獲得越來越多的關(guān)注。目前已證實(shí)在結(jié)腸癌[14]、前列腺癌[15]、甲狀腺癌[16]、膀胱癌[17]、腎癌[18]、鼻咽癌[19]和口腔鱗狀細(xì)胞癌[20]等組織中均有明顯的抑癌作用。近年來臺灣香檬活性成分川陳皮素被用于抗腫瘤、抗炎等方面。本研究選取肝癌、肺癌和宮頸癌細(xì)胞作為細(xì)胞模型，通過體外活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)臺灣香檬川陳皮素可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，川陳皮素可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。說明臺灣香檬化學(xué)活性成分川陳皮素在調(diào)控腫瘤發(fā)生與發(fā)展中扮演著重要角色，而腫瘤細(xì)胞生長往往是不可控的，細(xì)胞增殖與凋亡機(jī)制紊亂是造成腫瘤無限生長的關(guān)鍵因素。川陳皮素作為臺灣香檬的天然活性物質(zhì)，因其低毒性而成為有前景的藥物制劑。本研究表明，川陳皮素對腫瘤具抑制作用，為川陳皮素作為天然植物產(chǎn)物活性藥物提供理論依據(jù)。