不同采收期雷公藤甲素測定及其動態(tài)積累

袁玉虹，孫 艷，鄭郁善*

(1.福建林業(yè)職業(yè)技術學院，福建 南平 353000；2.福建農(nóng)林大學，福建 福州 350002)

雷公藤(Tripterygium wilfordii)又名斷腸草，為衛(wèi)矛科雷公藤屬攀緣藤本植物，是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有祛風除濕、活血通絡、消腫止痛、殺蟲解毒之功效[1]。雷公藤制劑在臨床上常用于治療自身免疫性疾病，如類風濕關節(jié)炎、腎炎、接觸性皮炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[2]。雷公藤分布區(qū)域較為廣泛，主要分布于我國長江流域和西南地區(qū)，如浙江、安徽、湖南、湖北、福建、廣東、廣西、云南等省區(qū)。近年來，雷公藤種植已成為福建山區(qū)主要脫貧致富途徑之一。

雷公藤的主要活性物質(zhì)為雷公藤甲素(Triptolide，C20H24O6)，又名雷公藤內(nèi)酯醇。雷公藤甲素藥用價值較高，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗生育等作用[3]。但其毒性大，臨床應用中治療量和中毒量非常接近，安全范圍小，劑量稍高其毒副作用則超過活性作用，因此雷公藤甲素含量是其重要的質(zhì)量指標[4]。目前，國內(nèi)外對雷公藤的研究多集中在育苗、栽培、良種選擇、組織培養(yǎng)等方面[5—10]，其臨床醫(yī)學應用、化學成分及測定[11—18]等方面也有較深入研究，而雷公藤甲素含量在不同采收期及各入藥部位的動態(tài)變化尚未報道。

本實驗以種植5年的雷公藤為試材，對其不同采收期內(nèi)各入藥部位雷公藤甲素含量的動態(tài)規(guī)律進行分析，為雷公藤人工采收、質(zhì)量評價和資源開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

LC-20AD液質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津儀器公司，SPD-20A紫外可見雙波長檢測器，SIL-20A自動進樣器，CTO-20A柱溫箱，CBM-20A系統(tǒng)控制器，LC solution工作站)，色譜柱(SinoChrom ODS-BP 5 μm，200 mm×4.6 mm)，旋轉蒸發(fā)儀(R-201，上海申勝生物技術有限公司)，數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司)，電子分析天平(CP214，奧豪斯儀器有限公司)。

1.1.2 試劑

雷公藤甲素標準品(中國藥品鑒定研究所，批號111567-201602)，色譜甲醇(德國 MERCK)，色譜乙腈(德國MERCK)，中性氧化鋁(200～300目)，超純水，甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醚均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 藥材

雷公藤為5年生成熟植株，樣品均采自福建省泰寧縣雷公藤規(guī)范化種植基地福建杉陽雷公藤產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，共收集6批不同采收期的雷公藤根、莖與葉部位(表1)。

表1 雷公藤樣品采集時間Table 1 Different collection time of Tripterygium wilfordii samples

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液配制

稱取雷公藤甲素對照品適量，加乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶中，溶液用0.45 μm微孔膜過濾，作為對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液配制

精密稱量雷公藤樣品粉末(過60目篩) 2 g于錐形瓶中，用80%甲醇溶液按料液比1:35浸提24 h，超聲處理35 min。用25 mL氯仿萃取3次，將所得膏狀物置于氧化鋁層析柱洗脫，旋轉蒸發(fā)洗脫液至干，殘渣用甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中。加甲醇至刻度線，搖勻，過濾，轉入樣品瓶待測，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為SinoChrom ODS-BP；流動相為甲醇-水(45:55)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長218 nm；柱溫40 ℃。取供試品溶液20 μL進行測定。

1.2.4 標準曲線繪制

分別從濃度為500 μg·mL-1標準液，依次倍比稀釋濃度為 250 μg·mL-1、125 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、31.25 μg·mL-1、15.625 μg·mL-1，在“1.2.3”色譜條件下進樣檢測，以雷公藤甲素對照品濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 精密度試驗

取同一濃度的雷公藤甲素標準品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄各次的峰面積，計算RSD值。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一雷公藤樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h依次進樣記錄峰面積，計算RSD值。

1.2.7 重復性試驗

精密稱量 5份雷公藤樣品粉末 2.0 g，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，在“1.2.3”色譜條件下進樣檢測，記錄峰面積，計算RSD值。

1.2.8 回收率試驗

精密稱量6份雷公藤樣品粉末，分別加入適量的雷公藤甲素對照品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，在“1.2.3”色譜條件下進樣檢測，測得雷公藤甲素含量，計算回收率和RSD值。

1.2.9 樣品含量測定

取6批次采收期雷公藤樣品，精密稱量各批次雷公藤樣品根、莖、葉粉末2.000 g，平行稱樣3次。按“1.2.2”方法制備供試品溶液，并在“1.2.3”色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，計算雷公藤甲素含量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件及適應性試驗

由圖1、圖2可知，雷公藤樣品中雷公藤甲素與其他成分分離效果良好。在“1.2.3”色譜條件下，雷公藤甲素的保留時間為10.52 min，已達到基線分離，分離度大于 1.5，理論板數(shù)大于 5000。結果表明，該方法在測定雷公藤甲素含量時具有良好的系統(tǒng)適應性。

圖1 雷公藤甲素對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of triptolide reference substance

圖2 雷公藤樣品中甲素色譜圖Fig.2 Chromatogram of triptolide in the sample of Tripterygium wilfordii

2.2 標準曲線

在“1.2.3”色譜條件下進行雷公藤甲素對照品定量測定，記錄雷公藤甲素的色譜峰保留時間及峰面積。以對照品濃度為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，即 Y=0.0115X+1.3594(R2=0.9997)。結果表明雷公藤甲素的濃度在 7.75～250 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3 精密度考察

按照“1.2.5”方法，取同一濃度雷公藤甲素標準品溶液，連續(xù)進樣6次，每次進樣20 μL，記錄每次進樣峰面積，計算峰面積平均值，得出RSD值為1.13%，表明儀器精密度良好，符合測定要求。

2.4 穩(wěn)定性考察

按照“1.2.6”方法，取同一雷公藤樣品溶液，在12 h內(nèi)每間隔2 h測定一次，記錄峰面積，其RSD值為1.07%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復性考察

按照“1.2.7”方法，平行制備5份供試品溶液，測定并記錄峰面積，計算RSD值為0.98%。表明該方法重復性良好。

2.6 回收率考察

按照“1.2.8”方法，制備6份供試品溶液，測定并記錄峰面積，計算加樣回收率和RSD值。結果顯示，雷公藤加樣回收率為 99.21%，RSD值為1.578%(表1)，表明該方法回收率較好。

表2 回收率試驗結果Table 2 Test results of recovery rates

2.7 雷公藤甲素含量的動態(tài)變化

由表3可以看出，采收時間對雷公藤根和葉的甲素含量有顯著影響，對雷公藤莖的甲素含量的影響不顯著。雷公藤整個生長周期中，7～8月雷公藤葉片中甲素含量最高，其次是根部，含量最少的為莖部；11～12月根部甲素含量最高，其次是葉片，甲素含量最少的仍為莖部。就雷公藤全年采收量各部位雷公藤甲素含量的總和而言，雷公藤葉片甲素的含量略高于根部，具有資源開發(fā)利用潛力。

表3 不同采收期雷公藤不同入藥部位的甲素含量(μg·g-1)Table 3 Contens of different harvesting periods of triptolide in different parts of Tripterygium wilfordii (μg·g-1)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤莖葉中含有大量的雷公藤甲素，因此，從資源利用角度講，可以將莖葉作為提取雷公藤甲素的生產(chǎn)原料[19]。孫乙銘等[16]、倪樂[20]研究發(fā)現(xiàn)，在不同套種模式下，雷公藤各部位甲素含量由高到低依次為根、葉、莖。但本研究顯示，不同采集部位和不同采收期下雷公藤甲素含量存在一定差異，在實驗周期內(nèi)，雷公藤甲素不同部位含量高低依次為葉、根、莖，可能是葉作為植物生長的重要營養(yǎng)器官，其代謝能力比根部旺盛，因此雷公藤葉片甲素含量較高。

本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤葉片甲素含量最高為7～8月，達 24.08 μg·g-1，11～12 月最低，為 15.44 μg·g-1，翌年又開始逐漸上升。一般7～8月雷公藤葉片光合作用強，代謝旺盛，可能產(chǎn)生并積累了大量甲素；11月至翌年1月雷公藤葉片開始枯萎，代謝減弱，溫度降低，導致葉片甲素含量降低，翌年3月雷公藤開始長新葉，代謝增強，葉片甲素含量又逐漸上升。雷公藤根部甲素含量在 11～12月最高，達21.71 μg·g-1，這一時期雷公藤地上部分停止生長，繁殖器官營養(yǎng)消耗大，導致莖、葉的活性成分轉移至根部，使根中甲素含量增加。這與斯金平等[21]報道的雷公藤體內(nèi)雷公藤甲素質(zhì)量分數(shù)在冬季至初春季最高基本一致。但在整個采收期內(nèi)雷公藤莖中甲素變化不大。

本研究探討了雷公藤甲素在不同采收期植物體內(nèi)積累的動態(tài)變化過程，建議生產(chǎn)中每年在7～8月采收雷公藤地上部分(莖葉)，11～12月采收雷公藤地下部分(根)，用于雷公藤甲素提取。