高效液相色譜法測(cè)定川陳皮素PLGA納米粒的含量

雒西萍，李維鳳，牛曉峰*，趙新榮，張 浩，李華妮(.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 7006;.西安碑林藥業(yè)股份有限公司，西安 70048)

川陳皮素(nobiletin，NOB) 又稱蜜橘黃酮，是從蕓香科柑桔屬橘子CitrusreticulaiaBlanco 果皮中提取的一種黃酮化合物[1-2]，據(jù)報(bào)道，川陳皮素對(duì)肺癌、腹膜腫瘤、胃癌、皮膚癌等多種癌細(xì)胞均具有極強(qiáng)的抑制活性[3]。但由于川陳皮素在乙醚等脂溶性溶劑及水中的溶解度極小，且口服給藥的生物利用度極低(僅約4%)，而藥物制成納米粒具有提高生物利用度、降低用藥次數(shù)、減少給藥量等特點(diǎn)。乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的藥用輔料，具有良好的組織相容性和生物可降解性。近幾年被大量用作納米載藥體系的骨架材料[4-5]，PLGA納米粒具有延長(zhǎng)藥物釋放時(shí)間、降低藥物毒性和刺激性的特點(diǎn)，適用于口服生物利用度低而又需長(zhǎng)期使用的藥物[6]。川陳皮素PLGA納米粒為一種具有抗癌作用的新型制劑，為了更好地發(fā)揮川陳皮素的藥理作用、控制制劑質(zhì)量，現(xiàn)采用高效液相色譜法測(cè)定PLGA納米粒中川陳皮素的含量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀；H-1850R高速冷凍離心機(jī)(湖南湘怡離心機(jī)儀器有限公司)；BP211D型電子天平(賽多利斯(北京)中國(guó)有限公司)；KQ-250B 型超聲波清洗儀(250 W，50 kHz，江蘇昆山儀器有限公司)。

1.2試藥 川陳皮素對(duì)照品(西安小草植物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)；川陳皮素PLGA納米粒(自制)；乙腈為色譜級(jí)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)不銹鋼柱；流動(dòng)相：乙腈-水(45∶55)；檢測(cè)波長(zhǎng)：333 nm；流速：1 mL·min-1。

2.2溶液的制備方法

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取川陳皮素對(duì)照品11.66 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液1 mL，加甲醇制成每1 mL含46.64 μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 總川陳皮素質(zhì)量濃度測(cè)定：精密吸取川陳皮素PLGA納米?；鞈乙?.5 mL，置于1.5 mL離心管中，加乙腈0.5 mL超聲(250 W，50 kHz)5 min，離心(14 000 r·min-1，6 ℃)10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

包封川陳皮素質(zhì)量濃度的測(cè)定：精密吸取川陳皮素PLGA納米?；鞈乙? mL，置于1.5 mL離心管中，離心(14 000 r·min-1，6 ℃)20 min，棄去上清液，殘?jiān)蛹兓礈?，離心(14 000 r·min-1，6 ℃)10 min，殘?jiān)右译? mL超聲(250 W，50 kHz)5 min，上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3空白對(duì)照溶液制備 精密吸取不含川陳皮素的空白PLGA納米粒混懸液0.5 mL，照上述供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.3專屬性考察 分別吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液，在上述2.1色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果供試品溶液在與對(duì)照品溶液保留時(shí)間相同位置有吸收峰出現(xiàn)，而空白對(duì)照溶液無(wú)吸收峰，即制劑中的輔料對(duì)川陳皮素測(cè)定不產(chǎn)生干擾。 見(jiàn)圖1。

2.4線性關(guān)系考察 分別吸取川陳皮素對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為46.64 μg·mL-1)2，6，10，14和18 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=170.15C+27.156，r=0.999 0，川陳皮素在93.28～839.52 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度考察 精密吸取質(zhì)量濃度為23.32μg·mL-1的川陳皮素對(duì)照品溶液10 μL，按上述2.1色譜條件，分別進(jìn)樣5次，測(cè)定川陳皮素的峰面積，結(jié)果RSD為0.83%，表明精密度良好。

圖1 HPLC圖

2.6穩(wěn)定性考察 精密吸取已測(cè)知含量的供試品溶液(5～10 ℃保存)，在0，4，8，12和24 h分別取樣10 μL，在上述2.1色譜條件下測(cè)定峰面積值，結(jié)果RSD為1.30%，表明溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 平行吸取5份川陳皮素PLGA納米粒混懸液，按供試品溶液項(xiàng)下的方法制備，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定川陳皮素的含量，結(jié)果本方法重復(fù)性良好，RSD為1.0%。

2.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取不含川陳皮素的空白納米粒混懸液9份各1 mL，分別準(zhǔn)確加入不同質(zhì)量濃度的川陳皮素對(duì)照品溶液，按照樣品測(cè)定項(xiàng)的方法操作，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9樣品測(cè)定 分別吸取川陳皮素PLGA納米?；鞈乙哼m量，按供試品方法制備，進(jìn)樣，測(cè)定川陳皮素的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 川陳皮素PLGA納米?；厥章蕦?shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 川陳皮素PLGA納米粒含量測(cè)定結(jié)果

包封率計(jì)算公式：包封率=包封NOB質(zhì)量濃度/總NOB質(zhì)量濃度×100%。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道有用高效液相色譜法測(cè)定藥材中川陳皮素的含量[7-8]，但用高效液相色譜法測(cè)定川陳皮素PLGA納米粒的含量筆者未見(jiàn)報(bào)道。本文采用低溫高速離心乙腈破解的方法測(cè)定川陳皮素PLGA納米粒包封的藥物量，但由于納米粒在制備過(guò)程中，所投放的藥物定會(huì)有些損失，所以直接通過(guò)測(cè)定包裹在納米粒中的藥量計(jì)算包封率并不準(zhǔn)確。我們采用乙腈為破解劑，分別測(cè)定納米粒中所包裹的川陳皮素和納米?；鞈乙褐袑?shí)際的總藥量，以此來(lái)計(jì)算納米粒的包封率。以乙腈-水(45∶55)為流動(dòng)相系統(tǒng)，樣品分離效果良好。該測(cè)定方法快捷、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，且其中的輔料不會(huì)對(duì)主藥含量測(cè)定產(chǎn)生干擾，因此可用于川陳皮素PLGA納米粒的質(zhì)量控制。

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