左旋多巴微囊胃內(nèi)漂浮片犬體內(nèi)藥物動力學研究

賀鑫韜，馬桂芝，滕 亮，馬文娜（.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，烏魯木齊 830054）

帕金森?。≒arkinson′s disease）又稱“震顫麻痹”，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。美國神經(jīng)協(xié)會對各種抗帕金森病藥物進行評估，結(jié)果表明，復方左旋多巴制劑（美多芭等）是所有帕金森病藥物治療中最有效的藥物［1］。但是該片劑使用方法繁瑣，給藥頻率高，中老年患者的用藥順應性差，同時左旋多巴在十二指腸處有一個較窄的吸收窗，普通制劑由于胃滯留時間短，無法實現(xiàn)充分吸收，導致制劑生物利用度不理想。

胃漂浮給藥系統(tǒng)是依據(jù)流體動力學平衡系統(tǒng)（hydrodynamcally balanced system，HBS）設計的在胃中密度小于胃內(nèi)容物密度（1.004～1.010g·cm－3）的給藥系統(tǒng)。由于制劑的密度小，口服后可漂浮在胃液上，使得藥物在胃腸道中總的釋放時間延長，增加了藥物在胃和十二指腸的吸收，降低毒副作用，提高了藥物的生物利用度［2］。微囊緩釋片是利用微囊技術(shù)制備緩釋單元，同時結(jié)合普通的壓片技術(shù)制備的新型緩釋制劑。微囊型緩釋制劑不僅具有普通緩釋制劑的優(yōu)點，同時利用刻痕壓片還可實現(xiàn)分劑量用藥。這是因為其最小緩釋單元為微囊，在分劑量使用過程中并不會破壞其緩釋結(jié)構(gòu)。

因此，課題組結(jié)合前期研究結(jié)果［3］，嘗試采用復合制劑技術(shù)將其研制成微囊胃漂浮片［4］，該微囊漂浮片具有緩釋、胃內(nèi)滯留以及可分劑量使用等特點，可以更好地滿足臨床用藥需求。本文在相關(guān)報道［5］的基礎上，建立了測定比格犬血漿中左旋多巴質(zhì)量濃度的HPLC法，并對左旋多巴微囊胃漂浮片的藥物動力學行為進行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（WAT270944，美國Waters公司），熒光檢測器（Waters e 2695，美國Waters公司）；分析天平（BS110S型，北京賽多利斯天平有限公司）；超低溫冰箱（DW－86L205，廣州傲雪低溫冰箱）；實驗室專用超純水機（Exceed－Cd－16A，成都康寧實驗專用純水設備廠）；超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；高速離心機（LG10－2.4A，北京醫(yī)用離心機廠）。

1.2 試藥 左旋多巴對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號100170－201003）；左旋多巴微囊胃內(nèi)漂浮片（自制，批號20121120每片98mg）；高氯酸（分析純，上海桃浦化工廠，批號950420）；鹽酸（分析純，新疆燒堿廠，批號：02042052）；乙二胺四乙酸（EDTA，分析純，天津福晨化學試劑廠，批號20080902）；磷酸二氫鉀（優(yōu)級純，天津新精細化工開發(fā)中心，批號20050215）；庚烷磺酸鈉（色譜純，上海展云化工有限公司，批號1104017）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）；水為超純水。

1.3 動物 健康Beagle犬6只，雄性，體質(zhì)量12±1 kg，由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院實驗動物科學研究部提供并飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2010－0001。倫理委員會審批號：IACUC－20120523004。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ODS－1C18柱（250 mm×4.6mm，5μm）；流動相：水－甲醇（95∶5），其中水相含 EDTA 0.08mmol·L－1、磷酸二氫鉀70 mmol·L－1、庚烷磺酸鈉2.08mmol·L－1；流速：0.5 mL·min－1；柱溫：35℃；進樣量：20μL；激發(fā)波長：278nm，發(fā)射波長：325nm。

2.2 血漿樣品預處理 取比格犬全血2mL，4 200 r· min－1低溫（8℃）離心10min，取上層血漿，置于離心管中，加入等量60mL·L－1高氯酸溶液，渦旋振搖2min，沉淀蛋白，以10 000r·min－1離心15 min，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后取20μL進樣分析。

2.3 方法專屬性 在2.1項的色譜條件下，空白血漿、左旋多巴對照品、空白血漿加左旋多巴對照品、實際血漿樣品按2.2項下處理后進樣，記錄色譜圖（結(jié)果見圖1），由圖1可知，左旋多巴對照品保留時間約為8min，內(nèi)源性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物與左旋多巴色譜峰基線分離，對左旋多巴的測定無干擾。

圖1 HPLC圖A.空白血漿；B.對照品溶液；C.空白血漿加左旋多巴對照品；D.給藥后1h血漿樣品；1.左旋多巴Fig.1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.reference solution；C.standard plasma；D.sample－after 1hadministration；1.levodopa

2.4 標準溶液的制備 精密稱取左旋多巴對照品0.005g，置于25mL量瓶中，用9mL·L－1的鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為左旋多巴儲備液（200 μg·mL－1）。取儲備液依次倍量稀釋成質(zhì)量濃度分別為200，100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56和0.78 μg·mL－1的系列標準溶液。

2.5 標準曲線與線性范圍 分別取空白血漿500 μL 9份，精密加入不同質(zhì)量濃度左旋多巴標準液50μL，使血漿中左旋多巴的質(zhì)量濃度分別為20，10，5，2.5，1.25，0.62，0.31，0.16 和 0.078μg·mL－1，按2.2項下依法操作，進樣20μL，記錄色譜圖。以待測物峰面積（Y）對左旋多巴質(zhì)量濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程：Y＝27 006.149 1 X＋479.768 7，r＝0.999 9（n＝8）。左旋多巴線性范圍為0.078～20 μg·mL－1，質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。采用信噪比法確定標準曲線的定量下線為（LLOQ）0.078μg·mL－1（S／N≥10）。

2.6 精密度與準確度實驗 取空白血漿500μL，按2.5項下方法配制成左旋多巴低、中、高3個質(zhì)量濃度（0.078，2.5和20μg·mL－1）的質(zhì)量控制（QC）樣品，每個質(zhì)量濃度進行5個樣本分析，連續(xù)測定3d，用隨行的標準曲線計算QC樣品的質(zhì)量濃度，測定日內(nèi)及日間的精密度，并與制備質(zhì)量濃度比較，求得方法的準確度，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，測定血漿中左旋多巴質(zhì)量濃度的分析方法的精密度（RSD）與準確度（RE）均在15%內(nèi)，符合生物樣品分析方法要求。

表1 左旋多巴精密度與準確度實驗結(jié)果Tab.1 Precision and accuracy of the HPLC method for levodopa（n＝5，±s）

表1 左旋多巴精密度與準確度實驗結(jié)果Tab.1 Precision and accuracy of the HPLC method for levodopa（n＝5，±s）

加入質(zhì)量濃度／μg·mL－1測得日間質(zhì)量濃度RSD／% 測得日內(nèi)質(zhì)量濃度RSD／% RE／%／μg·mL－1 ／μg·mL－1 0.078 0.068±0.004 8.10 0.064±0.09 13.52 12.81 2.5 2.45±0.143 5.81 2.45±0.18 7.20 2.04 20 19.16±0.781 4.07 19.20±0.81 4.24 4.21

2.7 穩(wěn)定性實驗 取空白血漿500μL，按2.5項下方法操作配制左旋多巴低、中、高3個質(zhì)量濃度（分別為0.078，2.5和20μg·mL－1）的 QC樣本，對每一質(zhì)量濃度進行5樣本分析；分別考察處理后的血漿樣品于室溫放置24h、血漿樣品在－80℃冰箱中長期冷凍貯藏（28d）及反復凍融的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。處理后的樣品溶液于室溫放置24h、血漿樣品在－80℃冰箱中長期冷凍貯藏（28d）及反復凍融3次，左旋多巴含量均穩(wěn)定，符合生物樣品測定的要求。

表2 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Tab.2 The results of sample stability test（n＝5）

2.8 提取回收率與基質(zhì)效應 取空白血漿500μL，照2.5項下方法，制備左旋多巴低、中、高3個質(zhì)量濃度（分別為0.078，2.5和20μg·mL－1）的質(zhì)量控制樣品（n＝5）。另取空白血漿500μL，加等量的60 mL·L－1的高氯酸，渦旋2min，以10 000r·min－1離心10min，取上清液，加入相應的左旋多巴對照品溶液，制成左旋多巴低、中、高3個質(zhì)量濃度（分別為0.078，2.5和20μg· mL－1）的未經(jīng)提取的對照樣品（n＝5）。取不同質(zhì)量濃度的標準溶液，用60 mL·L－1高氯酸稀釋制成低、中、高3個質(zhì)量濃度（分別為0.078，2.5和20μg·mL－1）的左旋多巴標準對照樣品（n＝5），進樣20μL檢測。結(jié)果表明，測定血漿中左旋多巴質(zhì)量濃度分析方法的提取回收率分別為108.62%±12.42%，113.89%±6.51%和105.05%±4.22%，基質(zhì)效應分別為 118.8% ±18.3%，92.7%±4.78%和90.60%±2.0%，均符合生物樣品分析方法的要求。

2.9 Beagle犬體內(nèi)藥物動力學實驗

2.9.1 血漿采集 6只健康Beagle犬，雄性，禁食12h（自由飲水）后，分別給予左旋多巴胃內(nèi)微囊漂浮片1片（每片含左旋多巴約100mg），并在給藥后多點前肢靜脈采血（給藥2h后給水，4h后進食），采血時間點為0.167，0.333，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，9和12h，所采血樣肝素抗凝，離心提取血漿于－80℃冰箱保存，待測。

2.9.2 數(shù)據(jù)處理 血樣按2.1項下HPLC色譜條件測定血藥質(zhì)量濃度，所得數(shù)據(jù)用中國藥理學會數(shù)學藥理專業(yè)委員會編制的3P97藥代動力學程序處理。根據(jù)AIC值判定左旋多巴微囊胃內(nèi)漂浮片在犬體內(nèi)的藥動學行為，符合單室模型。6只Beagle犬單劑量給予左旋多巴胃內(nèi)微囊漂浮片的平均血藥質(zhì)量濃度－時間曲線見圖2。對血藥質(zhì)量濃度進行處理，計算比格犬口服左旋多巴微囊漂浮片后的主要藥物動力學參數(shù)，分別為：t1／2（1.09±0.46）h，Cl（32.78±10.24）L·h－1，Ka（1.5±0.44）h－1，tmax（1.32±0.54）h，Cmax（1.33±0.31）μg·mL－1，AUC為（3.31±1.26）μg·h·mL－1。

圖2 比格犬口服左旋多巴微囊漂浮片后的平均藥－時曲線Fig.2 Mean plasma concentration vs time plots of Levodopa Microcapsules Intragastric Floating Tablets in Beagle dogs after a single oral administration

3 討論

3.1 左旋多巴的含量測定方法的選擇 在文獻報道中，高效液相成本比色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［6－7］低，儀器在國內(nèi)比較普及，其中熒光檢測比紫外［8－9］靈敏度高，同時比電化學法［10－11］簡便，而測定結(jié)果比毛細管電泳法［12］穩(wěn)定、重復性好，所以采用 HPLC－熒光檢測。

3.2 對照品溶液溶劑的選擇 由于左旋多巴在乙醇、氯仿中不溶，在水中微溶，在稀酸中易溶［13］，曾用純水溶解左旋多巴對照品，但實驗中發(fā)現(xiàn)，對照品的保留時間與經(jīng)過處理的樣品的RT值偏移比較明顯，因此，選用體外實驗時表現(xiàn)穩(wěn)定的稀鹽酸作溶劑配制左旋多巴對照品溶液。

3.3 樣品處理方法的選擇 沉淀法處理樣品易操作、效率高、成本低，故直接選擇考察蛋白沉淀劑，分別考察了等量和1／2量的200mL·L－1高氯酸、乙腈、氯仿與60mL·L－1高氯酸作為蛋白沉淀劑的分離效果，其中以60mL·L－1高氯酸處理后左旋多巴與相鄰峰分離效果最優(yōu)。同時，據(jù)報道，以高氯酸沉淀蛋白，當血樣與高氯酸體積比為1∶1時蛋白沉淀率可達99%。因此，選擇加入等量的60mL·L－1高氯酸進行樣品前處理。

3.4 液相條件的選擇 分別考察了下列條件對樣品測定結(jié)果的影響：柱溫（30，35和40 ℃）；流速（0.5，0.8和1.0mL·min－1）；流動相比例（水－甲醇為90∶10，92∶8和95∶5）；流動相pH 值（3.2，3.7和4.2）。結(jié)果表明，當流動相（pH 約為3.7）為水－甲醇（為95∶5）、流速為0.5mL·min－1、柱溫為35℃時，能夠獲得更為理想的色譜峰。

3.5 動物實驗的預考察 在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，直接給予Beagle犬左旋多巴片劑后1h左右，犬會出現(xiàn)不同程度的惡心，嘔吐出黃色的胃容物。為避免胃腸道不良反應影響藥物吸收，在實驗前30min先給予1片多潘立酮片以防止嘔吐。文獻報道［14］，左旋多巴與多潘立酮沒有藥物動力學相互作用。預實驗中發(fā)現(xiàn)左旋多巴在犬體內(nèi)達峰時間約為90～120min左右，而所采的24h的血樣中幾乎檢測不出左旋多巴，因此，調(diào)整采血時間點為0.167，0.333，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，9和12h。結(jié)果表明，該采血點設計能夠滿足藥動學研究的要求。

3.6 初步的藥動學研究結(jié)果 該微囊漂浮片中左旋多巴在比格犬體內(nèi)的藥動學行為符合單室模型。與文獻報道的美多芭藥代動力學參數(shù)相比，左旋多巴的的達峰時間延長，半衰期延長，具有比較明顯的緩釋制劑特征，提示漂浮片中左旋多巴的體內(nèi)滯留時間有所延長，這可能是因為漂浮片中左旋多巴的表觀分布容積發(fā)生改變的緣故。以上結(jié)果尚需通過生物利用度比較和多劑量給藥等予以確證。

4 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法測定比格犬體內(nèi)左旋多巴質(zhì)量濃度的方法。該法符合方法學的要求，具有準確、靈敏、可重復的特點，可用于開展左旋多巴微囊胃內(nèi)漂浮片比格犬體內(nèi)藥物動力學研究。

［1］Jankovie J.An update on the treatment of Parkinson′s disease［J］.MT Sinai J Med，2006，73：682－689.

［2］王銳利，張淑秋.胃漂浮片的研究進展［J］.山西醫(yī)科大學學報，2005，36（2）：260－262.

［3］李文英，馬桂芝，滕亮.左旋多巴微囊制備工藝的研究［J］.西北藥學雜志，2011，26（6）：442－445.

［4］Deleu D，Nonhway M G，Harsens Y.Clinical pharmacokinetic and pharmacodymmic properties of drugs used in the treatment of Parkinson′s Disease［J］.Clin Pharmacokinet，2002，41：261－309.

［5］袁靜，王平全，楊惠娣.高效液相色譜法測定左旋多巴／芐絲肼分散片血藥濃度及其藥代動力學研究［J］.中國新藥雜志，2001，10（2）：110－112.

［6］張曉燕，周威，楊靜，等.多巴絲肼膠囊在Beagle犬體內(nèi)的生物等效性［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42（10）：773－776.

［7］Vickers S，Stuart E K，Bhucker H.Further studies on the metabolism of carbidopa L－h(huán)ydrazine－3，4－dihydroxy－methyl benzenepropanoic acid monohydrate in the human，rhesus monkey，dog and rat［J］，Med Chem，1975，18（2）：134.

［8］路枚，黃雪梅，蒙大平.反相高效液相色譜法測定人血清中左旋多巴的濃度［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2001，21（10）：602－604.

［9］Chiara Muzzi，Erica Bertocci，Lucia Terzuoli，et al.Simultaneous determination of serum concentrations of levodopa，dopamine，3－O－methyldopa and a－methyldopa by HPLC［J］.Biomed Pharmacother，2008，62：253－258.

［10］柯蒙，林翠鴻，王長連.中國青年男性左旋多巴藥動學研究［J］.海峽藥學，2010，22（4）：157－159.

［11］王建，謝林，王大為，等.HPLC法測定人血漿中左旋多巴和卡比多巴濃度及其藥代動力學研究［J］.中國藥科大學學報，2004，35（3）：139－243.

［12］孟慧.高效毛細管電泳法測定血清中左旋多巴的含量［J］.人民軍醫(yī)，2004，47（6），323－325.

［13］國家藥典委員會.中國藥典 ［S］.二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：108－109.

［14］唐敏.多潘立酮與左旋多巴相互作用［J］.藥學情報通訊，1989，7（2）：132.