響應(yīng)面法優(yōu)化梔子中梔子苷的超聲-微波協(xié)同提取工藝

宋登鵬， 韓安艷

（十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰442000）

中藥梔子是茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis的干燥成熟果實，別名為黃梔子、山梔、白蟾、黃果子、山黃枝、黃梔、山梔子、水梔子、越桃、木丹等[1]。梔子性寒、味苦，歸心、肺、三焦經(jīng)，內(nèi)服具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血止血的功效，外用具有消腫止痛的功效[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，梔子具有保肝利膽[3]、降血糖[4]、降血脂、抗氧化[5]等作用，主要含有環(huán)烯醚萜類[6]、二萜類[7]、黃酮類[8]、揮發(fā)油類[9]、有機(jī)酸類[10]等成分。梔子是2002年國家衛(wèi)生部頒布的第一批藥食兩用物質(zhì)[11]，已被開發(fā)成梔子面粉[12]、梔子復(fù)合飲料[13]、梔子酒[14]、梔子油[15]等。

梔子中分離的環(huán)烯醚萜類成分大約30種，含量最高的是梔子苷，也是梔子發(fā)揮藥用價值的主要成分[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，梔子苷具有改善睡眠[18]、保肝利膽[19]、抗炎[20]、抗病毒[21]等藥理活性，且梔子苷也可制成天然食用著色劑梔子藍(lán)和梔子紅等。目前，梔子中梔子苷的提取方法有加熱回流提取法[22]、超聲提取法[23]、減壓提取法[24]、微波法[25]等。至今，超聲微波法[26-27]提取梔子中梔子苷的提取工藝還未見報道。本研究擬采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化梔子中梔子苷的超聲微波法提取工藝，并選用高效液相色譜（HPLC）法測定提取液中梔子苷的含量，以提高梔子苷的提取率，拓展梔子的應(yīng)用，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 藥品與試劑實驗用梔子果實購自湖北省十堰市太和醫(yī)院藥房。梔子苷對照品（上海源葉生物科技有限公司）；乙腈為色譜純，購自廣州市昱浩貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器GPD-1000C中藥材粉碎機(jī)（臺州國品樂機(jī)機(jī)械有限公司）；BP211D型1/10萬電子分析天平（德國賽多利斯公司）；日本島津LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器、SIL-20A自動進(jìn)樣器、UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津公司）；SK2510HP超聲清洗機(jī)（深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司）；XH-300A電腦微波超聲波足額和催化合成萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子苷含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件Hypersil C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），以乙腈-水（15∶85）為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL[28]。

2.1.2 對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品5.2 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙醇定容，制成濃度為0.052 mg/mL的對照品儲備溶液。將對照品適量稀釋100倍，即得對照品溶液。將對照品溶液適量用0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.1.3 供試品溶液的制備梔子藥材粉碎，過篩，準(zhǔn)確稱取梔子藥材1 g，加入60%的乙醇50 mL，稱質(zhì)量，按Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件超聲微波協(xié)同提取梔子苷，冷卻至室溫；60%乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液2 mL，置于25 mL量瓶中；加乙醇至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾。按照“2.1.1”項下的色譜條件進(jìn)樣，測定梔子提取液中梔子苷的含量。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將對照品溶液和供試品溶液根據(jù)“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，HPLC色譜圖見圖1。由圖1可知，在此色譜條件下，梔子苷可以獲得較好的基線分離。將對照品溶液按“2.1.1”項下的色譜條件分別進(jìn)樣1、2、5、10、15、20 μL測定峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計算，得回歸方程為Y=1 454 640X-249 227，R2=0.999 6。結(jié)果表明，梔子苷對照品在0.52~10.4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 梔子供試品及對照品高效液相色譜（HPLC）圖Figure 1 HPLC profile of the test substance and reference substance

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1精密度試驗精密吸取按“2.1.2”項制得的梔子苷對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示，梔子苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.43%，說明儀器的精密度良好。

2.1.5.2重復(fù)性試驗取梔子藥材粉碎，過篩，準(zhǔn)確稱取梔子藥材1 g，5份，分別編為供試品提取液1~5號。設(shè)定微波功率300 W，超聲功率300 W，提取時間12 min，按“2.1.3”項下供試品制備的方法制備供試品提取液。將獲得的溶液按“2.1.1”項下的色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示，梔子苷峰面積的RSD為2.71%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5.3穩(wěn)定性試驗取按“2.1.3”項下的方法制備的1號供試品提取液，按“2.1.1”項下的色譜條件分別于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示，梔子苷峰面積的RSD為1.45 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5.4加樣回收率試驗準(zhǔn)確稱取6份梔子粉末，各0.5 g，精確加入與樣品成分含量相等的梔子苷對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，將獲得的溶液按“2.1.1”項下的色譜條件進(jìn)樣測定，計算梔子苷的回收率。梔子苷的回收率為98.34%，RSD=2.29%（n=6），表明該方法的回收率良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取時間對梔子中梔子苷提取率的影響固定微波功率300 W，超聲功率300 W，提取時間分別 設(shè) 為3、6、9、12、15、18 min，其 余 按“2.1.3”項下的方法進(jìn)行梔子苷的提取，并用“2.1.1”項下的色譜條件測定梔子提取液中梔子苷的含量，并計算梔子苷提取率。

從圖2可以看出，梔子苷提取率隨著提取時間的延長呈現(xiàn)先上升后平緩下降的趨勢，提取時間達(dá)到12 min時，梔子苷的提取率最大。這可能是由于隨著提取時間的延長，超聲微波提取的各種效應(yīng)也隨之增強(qiáng)，有利于梔子苷的溶出。當(dāng)提取時間達(dá)到12 min時，梔子苷溶出完全。提取時間繼續(xù)延長，雜質(zhì)溶出逐漸增多，影響梔子苷的溶出，導(dǎo)致梔子苷的提取率下降。因此，選擇提取時間12 min作為后續(xù)條件優(yōu)化的參數(shù)。

圖2 提取時間對梔子苷提取率的影響Figure 2 The effect of extraction time on the yield rate of geniposide

2.2.2 微波功率對梔子中梔子苷提取率的影響固定超聲功率300 W，提取時間12 min，微波功率分別設(shè)為100、200、300、400、500 W，其余按“2.1.3”項下的方法進(jìn)行梔子苷的提取，并用“2.1.1”項下的色譜條件測定梔子提取液中梔子苷的含量，并計算梔子苷提取率。

從圖3可知，微波功率增大，梔子苷提取率快速增大。當(dāng)微波功率為300 W時，梔子苷提取率達(dá)到最大；微波功率繼續(xù)增大，梔子苷提取率下降。這是由于微波功率增大，產(chǎn)生的熱效應(yīng)越大，有利于梔子苷的提取。微波功率超過300 W后繼續(xù)增加，熱效應(yīng)的作用會導(dǎo)致部分梔子苷結(jié)構(gòu)的破壞，從而導(dǎo)致梔子苷提取率下降。因此，選擇微波功率300 W作為后續(xù)條件優(yōu)化的參數(shù)。

圖3 微波功率對梔子苷提取率的影響Figure 3 The effect of microwave power on the yield rate of geniposide

2.2.3 超聲功率對梔子中梔子苷提取率的影響固定微波功率300 W，提取時間12 min，超聲功率分別設(shè)定為100、200、300、400、500 W，其余按“2.1.3”項下的方法進(jìn)行梔子苷的提取，并用“2.1.1”項下的色譜條件測定梔子提取液中梔子苷的含量，并計算梔子苷提取率。

從圖4可以看出，超聲功率增加，梔子苷提取率增大，當(dāng)超聲功率達(dá)到300 W時，梔子苷率達(dá)到最大。這可能是由于超聲功率達(dá)到300 W時，所產(chǎn)生的空化效應(yīng)及熱效應(yīng)使梔子苷基本溶出完全。超聲功率繼續(xù)增加，空化效應(yīng)及熱效應(yīng)也隨之增加，會破壞梔子苷的結(jié)構(gòu)，增加雜質(zhì)的溶出。因此，選擇超聲功率300 W作為后續(xù)條件優(yōu)化的參數(shù)。

圖4 超聲功率對梔子苷提取率的影響Figure 4 The effect of ultrasonic power on the yield rate of geniposide

2.3 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化試驗的因素與水平根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以梔子苷提取率為響應(yīng)值，微波功率、超聲功率、提取時間為自變量，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken效應(yīng)面法試驗設(shè)計，優(yōu)化梔子中梔子苷的提取工藝。優(yōu)化試驗的因素與水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗的因素水平表Table 1 Levels and factors of Box-Behnken response surface methodology test

2.3.1 模型建立與方差分析利用軟件Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸，建立回歸模型，得到的二次多項回歸方程為：Y=9.058+0.247 5A-0.422 5B+0.237 5C+0.61AB+0.64AC+0.085BC-0.514A2-1.064B2-2.129C2。該模型的決定系數(shù)R2=0.991 1，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.979 7，說明所建立的模型穩(wěn)定可靠，可用于梔子苷提取的優(yōu)化及梔子苷提取率的預(yù)測。對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken response surface methodology test

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis results of regression model

根據(jù)表3數(shù)據(jù)可知，Box-Behnken效應(yīng)面法試驗所建立的回歸模型F=86.668 08，P<0.000 1，說明所建立模型非常顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義；失擬項P=00.186 796＞0.05，無失擬項存在，說明本試驗所選擇的因素合理。由P值大小可知，各因素對梔子苷提取率的影響順序為：微波功率＞提取時間＞超聲功率。其中，B、AB、AC、A2、B2、C2對梔子苷提取率影響較大，達(dá)到非常顯著水平（P＜0.01），A、C對梔子苷提取率影響為顯著水平（P＜0.05），B、C影響不顯著。

2.3.2 效應(yīng)面分析交互因素的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖5。從圖5可知微波功率與提取時間、超聲功率與提取時間的交互作用中等高線呈橢圓形，曲面較陡峭，微波功率與超聲功率交互作用的等高線呈圓形，曲面坡度較緩。交互項的響應(yīng)面和等高線的形狀可知微波功率與提取時間、超聲功率與提取時間取時間的對梔子苷提取率的影響較大，呈非常顯著，而微波功率與超聲功率對梔子苷的影響不顯著，與回歸分析的結(jié)果相吻合。

圖5 不同因素的交互作用對梔子苷提取率影響的響應(yīng)面圖（A1、B1、C1）及等高線圖（A2、B2、C2）Figure 5 The response surface diagrams（A1、B1、C1）and contour line plots（A2、B2、C2）for the effects of interaction of different factors on the yield rate of geniposide

2.3.3 工藝驗證及不同提取方法比較Box-Behnken效應(yīng)面法所擬合的響應(yīng)面及等高線形狀和已建立的回歸模型，得到梔子苷提取的最佳工藝參數(shù)為：提取時間12.655 min，微波功率286.713 W，超聲功率308.662 W，此條件下梔子苷的預(yù)測提取率為9.123%。為便于操作，將最佳提取工藝參數(shù)修正為：提取時間13 min，微波功率287 W，超聲功率309 W，梔子苷的提取率為9.03%，與預(yù)測值相符，表明所建立的模型預(yù)測性良好。

按照最佳工藝參數(shù)分別進(jìn)行微波提取和超聲-微波協(xié)同提取，同時根據(jù)參考文獻(xiàn)報道的超聲提取方法[29]進(jìn)行試驗，結(jié)果見表4。從表4可知，在提取時間相同的條件下，同其他提取方法相比，超聲-微波協(xié)同提取法獲得的梔子中梔子苷提取率最高，可用于梔子中梔子苷的提取。

表4 不同提取方法所得梔子中梔子苷提取率的比較Table 4 Comparison of the yield rate of geniposide obtained by different extraction methods

3 討論

前期通過預(yù)實驗確定了提取溶劑為60%乙醇，液料比為50∶1（mL/g）。超聲微波提取法得到的梔子苷提取率優(yōu)于文獻(xiàn)報道[30]，且耗時較少。這可能是因為微波能節(jié)約時間，超聲波能快速穿透細(xì)胞，超聲微波相結(jié)合的提取方法充分利用了微波的高效能和超聲的空化效應(yīng)，能夠強(qiáng)化傳質(zhì)、導(dǎo)致細(xì)胞分裂、提高滲透性，有利于成分的溶出。

本研究以梔子中梔子苷提取率為響應(yīng)值，選用Box-Behnken效應(yīng)面法對梔子苷提取中微波功率、超聲功率、提取時間的影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，得到梔子苷的最佳提取工藝為：提取時間13 min，微波功率287 W，超聲功率309 W，梔子苷的提取率為9.03 %。該方法提取率高于單獨(dú)微波提取和超聲提取，可以提高梔子苷的提取率，有利于梔子苷的開發(fā)利用。