全基因組測(cè)序技術(shù)在口岸耐多藥肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用探索

溫 穎 吳 健 吳培豐 高穎龍 陳 平 譚家輝 何洪濤 王向陽 張建明（通訊作者）廣州國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（廣東，廣州，510635）

趙 衛(wèi) 謝 茜 趙久波 余健海 覃直然 南方醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院（廣東，廣州，510515）

耐藥結(jié)核始終是結(jié)核病防控的焦點(diǎn)與難點(diǎn)［1］，尤其是耐多藥結(jié)核（MDR-TB），其傳播危害大、傳染期長(zhǎng)、治療費(fèi)用高（是普通肺結(jié)核的100倍）、治愈率低（約為50%），是影響結(jié)核病防控工作的最重要因素。2019年，全球近50萬人患單利福平耐藥結(jié)核（RR-TB），其中78%的人患MDR-TB［2］。若MDR-TB患者在口岸未能及時(shí)準(zhǔn)確檢出，造成跨境傳播［3-4］而至暴發(fā)［5］，將對(duì)我國(guó)境內(nèi)以及境外個(gè)人、家庭和國(guó)家造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。因此，我國(guó)口岸對(duì)傳染性肺結(jié)核的診斷不應(yīng)僅局限于臨床病原體的鑒定水平，快速、準(zhǔn)確且高通量的MDR-TB檢測(cè)技術(shù)，將是未來口岸結(jié)核病防控的必要工具。目前經(jīng)典的藥物敏感性檢測(cè)（DST）耗時(shí)長(zhǎng)（2-4周），而市場(chǎng)上主流的線性探針技術(shù)（LPA）、Xpert等MDR-TB檢測(cè)技術(shù)僅對(duì)目前已知的異煙肼（isoniazid，H）和/或利福平（rifampicin，R）的耐藥經(jīng)典位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，可能出現(xiàn)一定程度的漏檢［6］，均不適宜未來口岸的防控需求。全基因組測(cè)序（WGS）技術(shù)可對(duì)結(jié)核菌株耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)全面覆蓋，且具有準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點(diǎn)［6］。本研究應(yīng)用WGS技術(shù)對(duì)2008-2018年廣州國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心結(jié)核生物樣本庫(kù)中的MDR-TB相關(guān)菌株進(jìn)行檢測(cè)，并綜合患者流行病學(xué)及治療情況，探索單末端（SE）50WGS-NDA納米微球（DNB）技術(shù)在口岸MDR-PTB檢測(cè)方面應(yīng)用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料收集

本研究收集整理2008-2018年廣州國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心結(jié)核生物樣本庫(kù)中的結(jié)核臨床分離耐藥菌株（HR、RR、MDR和XDR）92株，按照2∶1比例隨機(jī)抽取庫(kù)中敏感菌株46株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種復(fù)蘇

138株結(jié)核生物樣本庫(kù)保藏菌株，取0.5mL接種于羅氏培養(yǎng)基，37℃孵育箱培養(yǎng)數(shù)周。挑取生長(zhǎng)菌落進(jìn)行抗酸染色（抗酸染色液，珠海貝索）及MPB64蛋白（結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒，杭州創(chuàng)新）快速初步鑒定。TB/NTM混合生長(zhǎng)、液化或生長(zhǎng)狀態(tài)不佳菌株者棄之。待肉眼可見有良好菌落生長(zhǎng)時(shí)，挑取適量菌落分別進(jìn)行BD960液體比例法藥敏試驗(yàn)和LPA分子藥敏檢測(cè)，進(jìn)一步確認(rèn)菌株的藥敏檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

1.2.2.1 BD960液體比例法 培養(yǎng)基中藥物的最終濃度。一線藥物：鏈霉素（Streptomycin，Sm）1.0μg/ml；異煙肼（isoniazid，H）0.1μg/ml；利福平（rifampicin，R）1.0μg/ml；乙胺丁醇（ethambutol，E）5.0μg/ml；丙嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）5.0μg/ml。二線藥物：氧氟沙星（ofloxacin，OFX）2.0μg/ml；阿米卡星（amikacin，AK）1.0μg/ml；卷曲霉素（capreomycin，CPM）2.5μg/ml；乙硫異煙胺（ethionamide，ETH）5.0μg/ml；對(duì)氨基水楊酸（paraaminosalicylicacid，PAS）4.0μg/ml。分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)管和BD960儀器由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

1.2.2.2 分子藥敏檢測(cè)法 采用熱裂解法提取上述藥敏試驗(yàn)對(duì)照管菌株DNA，進(jìn)行LPA（gene type MTBDRplus試劑盒，HainLifescience公司）檢測(cè)，對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和異煙肼、利福平耐藥實(shí)施分子鑒定和藥敏檢測(cè)，此法以下簡(jiǎn)稱基因型藥敏。DST表型藥敏結(jié)果與LPA基因型藥敏結(jié)果不一致的菌株實(shí)施重復(fù)2次的WGS檢測(cè)。

1.2.2.3 結(jié)果確診 經(jīng)上述2種藥敏方法確認(rèn)，無法鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTBC）或無法完成藥敏試驗(yàn)，棄之；菌株耐藥性若發(fā)生改變，以復(fù)蘇后確認(rèn)結(jié)果為準(zhǔn)。

1.2.3 定義

采用BD960液體比例法對(duì)結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行DST，僅對(duì)H耐藥的結(jié)核菌株稱為單耐異煙肼結(jié)核（HR-MTB）；僅對(duì)R耐藥的結(jié)核菌株稱為單耐利福平結(jié)核（RR-MTB）；同時(shí)對(duì)H和R耐藥的結(jié)核菌株稱為MDR-MTB；在MDR-MTB的基礎(chǔ)上，再加上對(duì)氟喹諾酮類藥物及二線注射類藥物中任意一種藥物耐藥的結(jié)核菌株稱為廣泛耐藥結(jié)核（XDRMTB）。

1.2.4 WGS檢測(cè)

1.2.4.1 DNA提取

納入研究的結(jié)核耐藥和全敏感菌株，提取細(xì)菌基因組DNA（細(xì)菌DNA提取試劑盒，Magen），詳見試劑盒說明書。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和Qubit分析儀對(duì)提取細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.4.2 DNB-WGS檢測(cè)

采用華大智造MSP100文庫(kù)制備儀和SEQ50基因測(cè)序儀進(jìn)行SE50單末端測(cè)序，按照5ng起始量，以H37Rv（NC_018143.2）標(biāo)準(zhǔn)株作為耐藥敏感株進(jìn)行對(duì)照測(cè)序，采用Aglient2100對(duì)制備的文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量控制，每株耐藥結(jié)核菌至少同時(shí)重復(fù)測(cè)序2次。當(dāng)每個(gè)測(cè)試Q30≧75%，total reads≧200M，SplitRate≧85%時(shí)，測(cè)序原始數(shù)據(jù)認(rèn)為可用于下一步分析，SNP突變閾值線設(shè)定為90。

1.2.5 結(jié)果分析

使用Excel工作表收集DST表型和LPA分子藥敏試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)常見的耐藥相關(guān)位點(diǎn)rpsL、katG、inhA、oxyR-ahpC、rpoB、embB、pncA、gyrA、gyrB、tlyA、rrs進(jìn)行測(cè)序，采用抗生素綜合檢索數(shù)據(jù)庫(kù)（CARD）進(jìn)行耐藥比對(duì)分析，所有表型全敏感菌株中均出現(xiàn)某一突變，或某突變占全敏感株≤10%，本研究將其表征為良性突變；耐藥菌株若僅單出現(xiàn)上述突變位點(diǎn)，那么WGS分析結(jié)果時(shí)則將其予以剔除，但以上突變我們會(huì)將其作為導(dǎo)致耐藥決定突變的潛在源進(jìn)行進(jìn)一步重復(fù)分析［6］；與耐藥尚存有疑義的突變，本研究將其列入耐藥分析。以BD960液體比例法DST結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)方法，比對(duì)LPA和WGS的耐藥檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 納入研究的MTB菌株的基本情況

92株耐藥結(jié)核菌經(jīng)復(fù)蘇并驗(yàn)證藥敏表型特性后，共有78株菌實(shí)施WGS檢測(cè)。HR菌株28株，分離自28例患者，年齡范圍為15-80歲，平均49.81±19.54歲，男性占71.43%（20/28），分別來自廣東（19）、廣西（5）、遼寧（1）、福建（1）、海南（1）和中國(guó)香港（1）。RR菌株14株，分離自3名患者，年齡范圍為31-55歲，平均45.6±12.03歲，男性占2/3，均來自廣東。MDR菌株35株，分離自29例患者，年齡范圍為2-77歲，平均年齡42.59±21.34歲，男性占61.72%（15/29），分別來自廣東（24）、貴州（5）、廣西（1）、河 南（1）、遼 寧（1）、江 西（1）、吉 林（1）、天 津（1）。XDR菌株1株，自1例天津72歲退休女性晨痰中分離。全敏感菌株45株，均分離自臨床PTB疑似患者晨痰，其中標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv共重復(fù)檢測(cè)6次（見表1）。

2.2 菌株LPA法檢測(cè)結(jié)果

LPA法對(duì)78株耐藥菌株進(jìn)行分子藥敏檢測(cè)，未檢出突變率為28.21%，LPA法檢測(cè)45株全敏感菌株，除2株檢出rpoB_H526D和rpoB_H526Y突變不納入下一步檢測(cè)外，其余檢測(cè)結(jié)果與DST表型結(jié)果一致（見表1）。

表1 92株耐藥結(jié)核菌株的基本情況

2.3 WGS制備文庫(kù)質(zhì)量控制

WGS每株菌株所制備的文庫(kù)均對(duì)其擴(kuò)增PCR片段進(jìn)行質(zhì)量控制，如14043號(hào)樣本（LPA未檢出突變，RR菌株）重復(fù)測(cè)序2次，制備的文庫(kù)1和文庫(kù)2的峰值均在180-300bp之間（見圖1a，b），片段比較集中，與預(yù)期結(jié)果相符。產(chǎn)物濃度＞5ng/μL，可滿足下一步DNB制備要求。

圖1 14043號(hào)樣本制備文庫(kù)1和文庫(kù)2的Aglient2100檢測(cè)結(jié)果

2.4 43株全敏感菌株WGS檢測(cè)結(jié)果

1株菌株檢出NTM/MTB混合感染。標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv未檢出任意突變。71.43%（30/42）菌株同時(shí)檢出gyrA_S95T和katG_R463L雙突變。檢出的良性突變有：gyrA_S95T，100%菌株均檢出；thyA_T202A、embC_N394D、embC -T270I、embB_E378A、embC_V981L、embR_C110Y，9.52%（4/42）菌株檢出；gyrA_E20Q、gyrA_G668D、gidB_E94D、embA_P913S、kas_G312S，7.14%（3/42）菌株檢出；embC_R378Q、ndh_V18A和kasA_G269S，2.38%（1/42）菌株檢出。

2.5 WGS與LPA檢測(cè)結(jié)果比較

78株耐藥結(jié)核菌株基因突變的LPA和WGS檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 LPA與WGS檢測(cè)耐藥結(jié)核菌結(jié)果的比較

2.5.1 LPA已檢出突變的56株菌株WGS檢出了13株katG_S315T1、10株rpoB_S531L、25株rpoB_S531L、1株rpoB_D516V和25株katG_S315T突變；WGS未檢出2株InhA_C15T突變 （但檢出1株ahpC_M109L突變），2株rpoB_H526D和2株rpoB_H526Y突變。

2.5.2 LPA未檢出突變的22株菌株

2.5.2.1 WGS檢出了No.2、18和21為NTM/MTB混合感染。

2.5.2.2 WGS檢出了No.10的KatG_S315T突變。

2.5.2.3 No.1，No.2-9和No.11-13共11株HR菌中，WGS均檢出了gyrA_S95T（與突變是否相關(guān)存有疑義［7］）和katG_R463L（與HR相關(guān)存有疑義［7-9］）雙突變，在No.5（來自海南1名30歲女性患者）和No.12（來自2008年WHO能力驗(yàn)證測(cè)試株）中分別檢出了已有研究［10-11］證實(shí)的與HR相關(guān)的kas_G312S和katG_S315N突變，在No.12中還檢出了與乙胺丁醇耐 藥 相 關(guān) 的embB_E378A［12-13］，embB_D328Y［11］和embC_T270I［14-15］突變。

2.5.2.4 3株RR No.14-16菌株來自廣東省一例53歲男性患者的初診和治療過程中復(fù)查的2次（療程近3年）痰樣，均檢出gyrA_E21Q、katG_R463L、rpoB_V170F和gidB_E92D多突變，3株菌檢測(cè)結(jié)果一致，為MDR-TB的可能性極大。

2.5.2.5 5株MDR No.18和21檢測(cè)結(jié)果均為MTB/NTM混合感染。No.17、19和20均檢出gyrA_S95T和katG_R463L雙突變，No.20還檢出RR相關(guān)rpoB_S450L、E耐藥相embB_M306V［10］、S耐藥相關(guān)rpsL_K43R和PZA耐藥相關(guān)pncA_P54L等多突變，與表型耐藥檢測(cè)結(jié)果一致。

2.5.2.6 1株XDR No.22檢出gyrA_S95T和katG_R463L雙突變。

3 討論

WGS技術(shù)應(yīng)用于臨床MDR-TB的診斷時(shí)代正在開啟，但以往研究尚存在對(duì)于特定基因突變是否與耐藥關(guān)聯(lián)明確性不足的問題，因此該技術(shù)應(yīng)用于臨床的準(zhǔn)確性和可行性仍有待進(jìn)一步評(píng)估［15］。在臨床測(cè)序檢測(cè)的前中后整個(gè)過程中，如何進(jìn)行菌株質(zhì)量、測(cè)序文庫(kù)和海量測(cè)序數(shù)據(jù)與臨床表型耐藥信息的有效對(duì)接分析等質(zhì)量控制工作，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足口岸臨床檢測(cè)快、準(zhǔn)、穩(wěn)的多項(xiàng)需求，是一項(xiàng)富有挑戰(zhàn)性的工作。本研究以口岸十多年積累的結(jié)核生物樣本庫(kù)［16］菌株為材料，選取SE50 WGS技術(shù)為平臺(tái)，運(yùn)用全程質(zhì)控理念，緊密結(jié)合患者臨床資料進(jìn)行綜合分析，以期在以往大多以菌株本身作為研究對(duì)象進(jìn)行的耐藥突變位點(diǎn)的研究基礎(chǔ)上，探索出一個(gè)適合口岸MDR-TB WGS的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。

臨床結(jié)核菌WGS檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確，首先在于嚴(yán)格控制臨床分離菌株的菌體質(zhì)量。本研究以生物樣本庫(kù)復(fù)蘇的菌株作為模擬樣本，從其生長(zhǎng)狀態(tài)、鏡下形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)方法鑒定、表型和分子藥敏試驗(yàn)等多維度進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)估。NTM或其它雜菌污染可能導(dǎo)致WGS菌種鑒定和耐藥分析的失敗，因此在WGS檢測(cè)前，檢測(cè)技術(shù)人員應(yīng)盡可能選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的純菌進(jìn)行檢測(cè)，以確保后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的有效性和準(zhǔn)確性。其次，為保證菌株藥敏特性的可比性，本研究對(duì)每一株復(fù)蘇菌株進(jìn)行了嚴(yán)格的表型和分子藥敏特征確認(rèn)。我們發(fā)現(xiàn)HR和RR菌株中分別有7株（1/5）和1株（1/15）菌耐藥特性由耐藥轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾校鳰DR和XDR菌株的耐藥性相對(duì)穩(wěn)定，未發(fā)生變化。表型藥敏比例法規(guī)定≥1%的分離株在臨界藥物濃度中生長(zhǎng)則判為該菌株耐藥，若排除人為操作原因?qū)е碌牟町悾琀R和RR菌株耐藥性發(fā)生變化可能是菌株本身即為耐藥/敏感混合型菌株，在不同的檢測(cè)中所取到的耐藥/敏感菌比例不同所導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果不同。LPA分子藥敏確認(rèn)結(jié)果顯示，其對(duì)H和R的耐藥基因突變漏檢率高達(dá)1/3（22/78），這與試劑盒本身設(shè)計(jì)有關(guān)，因此該法用于未來口岸耐多藥結(jié)核檢測(cè)并不是最佳選擇。

結(jié)核病耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，目前較為公認(rèn)的機(jī)制理論是MTB基因突變導(dǎo)致藥物靶標(biāo)發(fā)生變化，使藥物無法結(jié)合變異的靶位。結(jié)核表型DST檢測(cè)技術(shù)發(fā)展緩慢，操作人員技術(shù)要求高，操作流程復(fù)雜，某些情況下檢測(cè)結(jié)果還有可能存在不可靠，因此快速精準(zhǔn)的分子檢測(cè)技術(shù)將成為未來的發(fā)展方向。鑒于商售分子檢測(cè)技術(shù)存在的各種問題，WGS技術(shù)將為MDR-TB快速準(zhǔn)確檢測(cè)開辟一條新的道路，目前其主流有基于合成測(cè)序法的Hiseq、連接測(cè)序法的SOLiD和以聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)（cPAS）及DNA納米球（DNB）為核心技術(shù)的三大類測(cè)序平臺(tái)。本研究選取國(guó)產(chǎn)平臺(tái)的后者為基礎(chǔ)，采用單末端50bp讀長(zhǎng)，測(cè)序深度為50X，進(jìn)行結(jié)核單菌WGS檢測(cè)，整體檢測(cè)及分析時(shí)間（Turn around Time，TAT）約為30h，隨著測(cè)序儀器性能和便攜性的進(jìn)一步提升，TAT可縮減至24h內(nèi)，雖與目前商售分子藥敏檢測(cè)3-6h相比，還有更進(jìn)一步的空間，但其具有高通量和突變檢測(cè)覆蓋全，可進(jìn)行追蹤傳播鏈等［17］的優(yōu)點(diǎn)，一旦耐藥突變與臨床患者真實(shí)情況可以準(zhǔn)確對(duì)接并互譯，那么其在未來結(jié)核病綜合防控中將具有良好的應(yīng)用前景。

WGS臨床檢測(cè)的成敗和優(yōu)劣，制備文庫(kù)的質(zhì)量，測(cè)序數(shù)據(jù)的步步有效篩選和WGS軟件解讀突變與臨床菌株耐藥結(jié)果的有效匹配性是整個(gè)檢測(cè)的關(guān)鍵與難點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)影響文庫(kù)制備的好與壞，主要在于酶切和建庫(kù)方法的選擇。我們對(duì)酶的組分和打斷方式（體積、溫度和時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化，建庫(kù)方式選取儀器法，最終構(gòu)建的文庫(kù)穩(wěn)定性和質(zhì)量明顯優(yōu)于手工法。獲取WGS下機(jī)數(shù)據(jù)后，本研究將首先對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量分析，soapnuke數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾后，與MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株及NTM菌株參考序列進(jìn)行序列比對(duì)進(jìn)行菌種鑒定，再經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾、組裝，進(jìn)而與CARD耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，統(tǒng)計(jì)整理有意義耐藥突變信息，最后基于文獻(xiàn)報(bào)道及臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。

結(jié)核患者在治療期間或出現(xiàn)耐藥后，常發(fā)生NTM/MTB混合感染，這時(shí)實(shí)驗(yàn)室常常因?yàn)镹TM與MTB性狀相似導(dǎo)致難以分離出純結(jié)核菌，致使DST表型和常規(guī)分子檢測(cè)失敗或結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究設(shè)定當(dāng)結(jié)核單菌中混雜NTM量超過5%時(shí)，鑒定為MTB/NTM混合感染，本研究共檢出4例NTM/MTB混合感染菌株，為臨床醫(yī)師確定后續(xù)治療方案提供了更為全面的輔診證據(jù)。目前本研究平臺(tái)一旦鑒定出NTM/MTB混合感染菌株，則終止后續(xù)耐藥分析，原因在于所獲數(shù)據(jù)量不足以支持后續(xù)分析，今后我們將進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)與分析系統(tǒng)，在文庫(kù)構(gòu)建前將起始DNA的投入量增大20-40倍至100-200ng，以達(dá)到對(duì)目標(biāo)菌耐藥性進(jìn)行有效分析的目的。

MDR-TB兩種抗結(jié)核藥物H和R，H是一種抗結(jié)核藥物前體，需通過katG編碼的觸酶過氧化物酶活化產(chǎn)生游離的自由基，然后其攻擊細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)藥物靶點(diǎn)發(fā)揮藥效。當(dāng)katG基因（編碼的觸酶過氧化物酶是唯一能活化異煙肼前體的酶）發(fā)生點(diǎn)突變（突變頻率為50%-80%）、堿基缺失或者插入時(shí)，觸酶過氧化物酶活性下降或喪失，組織H變成活性形式，從而使MTB對(duì)H產(chǎn)生不同程度的耐藥［18］。HR高水平耐藥以katG_S315T突變?yōu)橹鳎退侥退巌nhA突變（突變頻率為15%-43%）為輔，inhA突變又以啟動(dòng)子區(qū)-15（C→T）突變?yōu)橹鳎?9］，控制解毒酶基因編碼oxyR-ahpC基因的突變也會(huì)導(dǎo)致HR的發(fā)生，其突變頻率為10%-15%。目前商售檢測(cè)試劑突變位點(diǎn)的覆蓋率總體為70%-90%，少有覆蓋ahpC基因突變。抗結(jié)核藥物R，通過與rpoB基因編碼的細(xì)菌RNA聚合酶β-亞基結(jié)合，干擾、抑制細(xì)菌RNA的合成，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。rpoB基因的單個(gè)堿基突變或數(shù)個(gè)堿基聯(lián)合突變或堿基的插入和缺失共30多種，突變常發(fā)生于在507-533位點(diǎn)間，以S511L、A516V、H526A、H526D、S531L突變?yōu)槌Ｒ姟?/p>

本研究構(gòu)建的WGS SE50檢測(cè)平臺(tái)系統(tǒng)對(duì)結(jié)核耐藥常見基因突變katG_S315T1、rpoB_S531L等均穩(wěn)定檢出。常規(guī)近七成LPA分子藥敏無法檢出突變的菌株中，我們?cè)贖R、MDR和XDR菌株中均同時(shí)檢出了gyrA_S95T和KatG_R463L雙突變，在3株LPA未檢出突變的RR菌株中檢出了KatG_R463L突變，雖然KatG_R463L突變是否為H的耐藥決定性突變還存在爭(zhēng)議，但gyrA_S95T和KatG_R463L雙突變是否存在協(xié)同作用，KatG_R463L與其它突變以期致菌株成為MDRTB，有一定的可能性，我們需要后續(xù)更進(jìn)一步的研究去證實(shí)。LPA法無法檢出來自同一患者治療前后的3株RR菌株，除檢出KatG_R463L突變外，還檢出了與氟喹諾酮類耐藥相關(guān)的gyrA基因E21Q和G668D突變，與RR相關(guān)且常發(fā)生在北京株的rpoB_V170F［16］和與抗結(jié)核二線注射類藥物相關(guān)的gidB_E92D突變，上述突變的存在可能與患者的難治性相關(guān)。對(duì)于LPA未檢出突變的20號(hào)MDR菌株，WGS檢出的突變可以很好地解釋其表型耐藥結(jié)果。對(duì)于LPA未檢出突變的XDR菌株，WGS檢出了gyrA_S95T和katG_R463L雙突變，這進(jìn)一步說明上述兩突變對(duì)于結(jié)核耐多藥及以上程度耐藥的良好的預(yù)測(cè)作用。對(duì)于HR低水平耐藥突變inhA_C15T和rpoB526位點(diǎn)突變，因尚未將其納入分析范疇而致漏檢，未來的研究中我們將在現(xiàn)有基礎(chǔ)之上，不斷完善耐藥解讀庫(kù)，使之與臨床匹配度不斷增高。

2020年中國(guó)防新冠疫情最有效的措施便是隔離，如果未來口岸能通過WGS檢測(cè)及時(shí)有效發(fā)現(xiàn)攜帶MDR-TB的旅行者，就有可能及時(shí)執(zhí)行隔離措施，防止MDR-TB的擴(kuò)散。