CRISPR技術(shù)在蚊媒傳染病防控中的應(yīng)用

陳 峰 唐曉宇 南通海關(guān)綜合技術(shù)中心（江蘇，南通，226005）

隨著“一帶一路”倡議的推進，蚊媒傳染病從國外地區(qū)傳到內(nèi)地的幾率越來越大。在我國境內(nèi)產(chǎn)生傳播、在局部地區(qū)形成流行性病例的風(fēng)險也越來越大，在極大程度上威脅到人類健康與社會發(fā)展。我國曾自按蚊、庫蚊與伊蚊內(nèi)提取出很多不同的蟲媒病原體，自動物與人類血清內(nèi)檢出了不同蟲媒病原體的抗體，也發(fā)現(xiàn)了多個輸入性病例；蚊類最強活動階段，出現(xiàn)了病毒性腦炎與原因不清的發(fā)熱病例，可見，尚未探明的未知蟲媒病原體可能存在于蚊類體內(nèi)，為此檢測水平的提升尤為重要。截止當(dāng)前自蚊類體內(nèi)已檢出了將近300種的病原體，就世界各地而言，每年蚊媒傳染病可導(dǎo)致巨大疾病壓力的產(chǎn)生。近年來，由于科技的飛速發(fā)展，基因編輯技術(shù)開始應(yīng)用蚊媒傳染病研究方面［1］?；蛐揎椫饕扇∫哉婧宿D(zhuǎn)錄因子為基礎(chǔ)的ZFN（鋅指核酸內(nèi)切酶）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶2種技術(shù)，但這2項技術(shù)因復(fù)雜的設(shè)計、較低的效率等缺陷使得其相對局限，不能實現(xiàn)廣泛推行［2］。CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)始自20世紀(jì)90年代，其在生物化學(xué)實驗中的首次應(yīng)用是在7年后，隨即于極短時間內(nèi)成為許多領(lǐng)域（如微生物學(xué)、農(nóng)業(yè)與人類生物學(xué)等）應(yīng)用最為廣泛的一類基因編輯工具［3］。利用CRISPR技術(shù)可以實現(xiàn)病毒自身基因向細(xì)菌的整合，借助細(xì)菌的細(xì)胞工具來服務(wù)于病毒基因復(fù)制，為了有效清除來自病毒的入侵基因，細(xì)菌完成了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的進化，其能夠利用此系統(tǒng)輕易地切除掉侵入自身基因組的病毒基因，此免疫系統(tǒng)只存在于細(xì)菌中［4］。CRISPR技術(shù)通過基因編輯實現(xiàn)對生物DNA序列的添加、修剪、替換、切斷操作，從而改變生物體的某些特性［4］。CRISPR技術(shù)的開展為蚊蟲生理、生化、發(fā)育、宿主同病原體間的聯(lián)系等多個方面的基礎(chǔ)性分子生物研究配備了靶標(biāo)特異性的修飾工具，為蚊媒傳染病控制技術(shù)的提升開辟出新路徑。

1 CRISPR技術(shù)研究現(xiàn)狀

1.1 CRISPR技術(shù)簡介

以目前應(yīng)用最廣泛的發(fā)現(xiàn)于化膿型鏈球菌中的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)為例，其由下述3部分構(gòu)成：其一為特異性的CRISPR相關(guān)RNA（即“cr-RNA”）；其二為反式激活的crRNA （即“tracr-RNA”）；其三為CRISPR相關(guān)的核酸內(nèi)切9（即“Cas9”）［5］。此外，之后的相關(guān)學(xué)者實現(xiàn)了內(nèi)含靶向指導(dǎo)序列的crRNA向tracrRNA內(nèi)有效融合，從而建立了單鏈導(dǎo)向RNA（即“sgRNA”），可以代替cr-RNAtracrRNA復(fù)合體，為Cas9核酸內(nèi)切酶對雙鏈DNA進行定向切割提供指導(dǎo)［6］。總體來說，CRISPRCas反應(yīng)由下述3個階段構(gòu)成。（1）第一階段，屬于適應(yīng)階段。此階段，蛋白復(fù)合物Cas1-Cas2切除目的DNA序內(nèi)的Protospacer（原型間隔子），同時完成此Protospacer向5’末端的CRISPR重復(fù)序列的插入，由此得到1個新的間隔子［7］；（2）第二階段，屬于表達與加工階段。此時，CRISPR序列和前一步驟所得新間隔子聯(lián)合轉(zhuǎn)錄，得到前體crRNA （Precr-RNA），同時借助特殊的Cas9加工成成熟的crRNA；（3）第三階段，屬于干擾階段。此時，crRNA結(jié)合Cas9蛋白，得到復(fù)合體，能夠?qū)AM（原型間隔序列毗鄰基序）前的靶點序列進行識別，活化Cas9內(nèi)HNH與RuvC結(jié)構(gòu)域，從而具備切割作用，借助此功能可以讓DNA雙鏈斷開（DSBs），再通過機體相關(guān)自我修復(fù)途徑，諸如NHEJ（非同源末端連接）或HDR（同源修復(fù)）等，順利完成基因組的定點插入、敲除或修飾［8］。

1.2 研究現(xiàn)狀

CRISPR所指為內(nèi)含若干短同向重復(fù)的基因座，它的發(fā)現(xiàn)來源于已經(jīng)被測序的細(xì)菌基因中。作為原核的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，CRISPR發(fā)揮相應(yīng)作用，可提供針對入侵的外源核酸的獲得性抗性。外源DNA的短片段（即“間隔區(qū)”）向CRISPR重復(fù)序列內(nèi)的基因組整合，作為CRISPR元件保留過去暴露的記憶［9］。這些被留作記憶的間隔區(qū)通過與真核生物內(nèi)RNAi相似的途徑來識別與沉默外界遺傳物質(zhì)。Cas蛋白（CRISPR相關(guān)蛋白）是CRISPR系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮關(guān)鍵作用的一類蛋白質(zhì)成分。

CRISPR技術(shù)的兩大豪門實驗室分別開發(fā)出了一種工具。張鋒實驗室利用Cas13蛋白的天然RNase活性開發(fā)和優(yōu)化了一種方法，包括SHERLOCK和SHERLOCK v2。Jennifer Doudna的實驗室則利用Cas2a的非特異性ssDNA降解開發(fā)出另一種稱為DETECTR的方法。

檢測核酸的時候，大家都希望特異性和靈敏度越高越好。然而，目前的檢測方法要么缺乏靈敏度，要么缺乏特異性，要么太貴太復(fù)雜，總之，缺點一大堆。好在，科學(xué)家近日利用Cas9蛋白的變體Cas13和Cas12a開發(fā)出簡單又便宜的平臺，能夠可靠檢測低水平的核酸。

SHERLOCK和DETECTR分別利用Cas13和Cas12a對鄰近ssRNA和ssDNA的切割和降解來切割和激活報告基團，隨后對這個報告基團產(chǎn)生的信號進行測定，即可確定感興趣的DNA、RNA或突變是否存在。這兩個系統(tǒng)都證實了CRISPR在診斷上的潛力。

2 蚊媒傳染病常用檢測方法與CRISPR技術(shù)對比分析

2.1 蚊媒傳染病病毒抗體檢測

采用生物醫(yī)療公司生產(chǎn)的相關(guān)病毒試劑盒檢測患者急性期血清中的病毒抗體。該試劑采用膠體金法，具體原理為：蚊媒傳染病病毒抗體分別預(yù)先包被在試劑條上，可捕獲蚊媒傳染病病毒抗體，與膠體金復(fù)合物（包含多型蚊媒傳染病病毒異性抗原）結(jié)合后如為陽性即可顯色。

抗體檢測是判斷是否感染蚊媒傳染病的間接證據(jù)。依據(jù)血檢測的要求，用于血清檢驗的樣本比較容易收集，而且在收集過程中注意規(guī)范就可以得到高質(zhì)量的標(biāo)本，這個過程便捷快速，對檢測人員來講也更加安全，不容易被感染?？贵w是病人體內(nèi)受到病毒刺激后而產(chǎn)生的物質(zhì)，為是否感染的間接證據(jù)。

2.2 蚊媒傳染病患者血清RNA檢測

蚊媒傳染病病毒RNA檢查采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法，也被稱為核酸檢測。測定試劑盒主要選擇熒光定量PCR技術(shù)，首先將蚊媒傳染病病毒（RNA結(jié)構(gòu)）轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的DNA結(jié)構(gòu)。RNA結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，通過逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA原料的作用，完成RNA逆轉(zhuǎn)錄，兩條鏈分開，生成包含病毒信息的DNA單鏈結(jié)構(gòu)［10］。然后進行PCR擴增。整個檢測的核心就是讓DNA不斷自我復(fù)制，探針與DNA結(jié)合時，熒光結(jié)構(gòu)被抑制不發(fā)光；然后，DNA在聚合酶的作用下，開始自我復(fù)制，熒光結(jié)構(gòu)脫落，開始發(fā)光。為了確保能夠探測出熒光信號，一般循環(huán)設(shè)定為40次。在不存在病毒的檢測對象中，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄不會產(chǎn)生靶基因的擴增，所以檢測結(jié)果是熒光信號正常，不會出現(xiàn)增強的現(xiàn)象。

蚊媒傳染病也存在潛伏期和窗口期，只不過比較短，人體在感染之后，經(jīng)過病毒的繁殖以及自身免疫系統(tǒng)的作用，要經(jīng)過3-7d左右才會在患者體內(nèi)生產(chǎn)抗體，這樣才會被檢測出來。在蚊媒傳染病病毒侵染患者的時候，最先在人體內(nèi)存在的是蚊媒傳染病病毒的RNA，利用血清檢測是無效的，只能依靠PCR的方法進行排查和篩選，在病毒RNA出現(xiàn)之后一段時間人體才會產(chǎn)生IgM抗體，這種抗體可以使用間接法進行檢測。目前對病毒的檢測都依靠試紙進行檢測，檢測的對象就是抗體，這種方法無法避免窗口期和潛伏期的風(fēng)險［11］。因此可以知道常規(guī)性的檢測手段在檢測蚊媒傳染病的過程中容易檢測失效，這是一個很大的缺點。而利用逆轉(zhuǎn)錄PCR法進行檢測，能夠準(zhǔn)確地查出病毒核酸是否存在于患者體內(nèi)，并給出可信的診斷結(jié)果，相比于其他方式靈敏度是最高的。

2.3 CRISPR技術(shù)檢測

CRISPR技術(shù)檢測是將Cas12a酶和CRISPR RNA（crRNA）結(jié)合，構(gòu)成一個復(fù)合體。當(dāng)crRNA與病毒RNA上的特異性序列相結(jié)合之后，能夠激活Cas12a酶［12］。Cas12a酶被激活后，能夠?qū)Ω浇膯捂淩NA分子進行切割，研究人員同時在RNA上添加熒光分子，當(dāng)RNA被切斷后，會釋放出熒光信號。此時，對熒光信號進行捕捉，就能檢測到病毒特異性序列的存在［13］。以前基于這一原理的CRISPR檢測為了提高檢測的靈敏度，會通過PCR擴增技術(shù)擴大樣本量。而這款檢測技術(shù)并不需要RCR擴增的過程，就可以直接定量檢測樣本中的病毒RNA水平，大大縮短了檢測時間。蚊媒傳染病檢測對于控制疾病傳播、及早診斷治療具有重要意義。熒光定量PCR由于高靈敏度和特異性成為了蚊媒傳染病檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。由于設(shè)備昂貴、操作繁瑣，熒光定量PCR技術(shù)很難用于現(xiàn)場即時檢測。所以，研究人員一直致力于研究如何將CRISPR基因編輯法應(yīng)用于蚊媒傳染病的檢測中，提高蚊媒傳染病的檢測時間［14］。經(jīng)過多年的研究，目前CRISPR技術(shù)檢測已經(jīng)成熟并且運用廣泛，CRISPR法檢測過程易于操作，需求的材料僅僅是提純之后的核酸，檢測步驟只有簡單的3個環(huán)節(jié)，檢測結(jié)果能夠在1h內(nèi)出來，十分便捷快速。

3 基于CRISPR技術(shù)的蚊媒病毒檢測存在的問題

相對于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，基于CRISPR技術(shù)的蚊媒病毒檢測技術(shù)具有更高的靈敏度，更好的特異性，而且不依賴于昂貴裝置以及操作者的專業(yè)性，方便快捷，成本低廉，因此成為生物檢測領(lǐng)域的耀眼新星。然而，目前所使用的基于CRISPR技術(shù)的蚊媒病毒檢測技術(shù)還存在一些不足，主要體現(xiàn)在以下方面：

3.1 基于CRISPR技術(shù)的蚊媒病毒檢測技術(shù)一般需使用RNA熒光報告探針，但RNA容易降解，致使可能出現(xiàn)假陽性的檢測結(jié)果［15］。

3.2 DNA或RNA的有效獲取是核酸檢測的基礎(chǔ)，簡便快捷無需依靠儀器即可有效獲取DNA或RNA，是CRISPR技術(shù)在蚊媒病毒檢測中即時應(yīng)用的保障，因此，需要進一步開發(fā)針對植物或動物組織DNA或RNA的簡便獲取技術(shù)。

3.3 由于單獨使用Cas12檢測的靈敏度偏低，基于CRISPR/Cas12的核酸檢測技術(shù)一般需要2個反應(yīng)步驟，第一個步驟是擴增反應(yīng)，第二個步驟是將擴增的樣本加入到包含Cas12蛋白和其他反應(yīng)試劑的試管中進行檢測反應(yīng)，這不但增加了檢測流程的復(fù)雜性，而且樣本在轉(zhuǎn)移步驟中可能被污染。因此，需要進一步開發(fā)更為簡便的檢測手段，讓擴增RNA或DNA的步驟和Cas12蛋白檢測的化學(xué)反應(yīng)能夠在同一個試管中進行，或挖掘更多新型Cas并建立更為簡單高效的無需擴增的CRISPR/Cas檢測方法。

4 展望

基于CRISPR系統(tǒng)的蚊媒病毒檢測的靈敏性和特異性非常突出，已經(jīng)達到amol/L甚至zmol/L的范圍，并能檢測點突變，這必將在核酸測定方面起到非常關(guān)鍵的作用。對于檢測速度，最快的分析至少需要15 min，以后可以通過鑒定新的Cas蛋白和工程改造已存在的Cas蛋白，以及優(yōu)化信號放大系統(tǒng)，以進一步提高檢測速度。CRISPR技術(shù)的蚊媒病毒檢測技術(shù)使用了無需核酸提取的病原體檢測（HUDSON）、等溫擴增以及試紙條檢測，為了檢測更加便捷，今后應(yīng)發(fā)展一步診斷法，包括病原體核酸釋放、預(yù)擴增、CRISPR-Cas誘導(dǎo)反應(yīng)和信號讀出等。未來還可以將人工智能（artifificial intelligence，AI）與CRISPR-Cas13診斷測試相結(jié)合，構(gòu)建一個快速、準(zhǔn)確和更智能的感染性病原體診斷預(yù)警系統(tǒng)。隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)菌、古菌和細(xì)菌大病毒中的不斷發(fā)現(xiàn)，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)得以不斷豐富發(fā)展。如CRISPR基因編輯先驅(qū)蛋白Cas9，失去切割活性的變體dCas9也可被固定在石墨烯納米材料上，成為核酸檢測芯片。Cas phi是新近發(fā)現(xiàn)的具有功能的最小分子量的Cas12類蛋白，識別和切割dsDNA被激活后，同樣具有ssDNA附帶切割活性。因此以CRISPR/Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ)的核酸檢測技術(shù)，必將彌補以PCR為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)核酸檢測技術(shù)的不足，可顯著促進諸多領(lǐng)域的發(fā)展，包括食品、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)學(xué)等。