山苦荬保肝活性部位篩選及其化學(xué)成分研究

孫麗君 常福厚 白圖雅 王玉華

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）09-1089-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.09.11

摘 要 目的：篩選山苦荬保肝活性部位并對其化學(xué)成分進(jìn)行研究。方法：采用系統(tǒng)溶劑法，以70%乙醇對山苦荬藥材進(jìn)行提取，用不同溶劑對所得提取物進(jìn)行萃取，分別得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位和剩余水部位。以對乙酰氨基酚誘導(dǎo)人肝細(xì)胞HL-7702復(fù)制肝損傷細(xì)胞模型，采用MTT法檢測上述各部位（40 μg/mL，均以生藥量計）對損傷細(xì)胞的保護(hù)作用并篩選活性部位。采用硅膠柱、葡聚糖凝膠柱色譜等分離手段對活性部位進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜（氫譜、碳譜）數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果：經(jīng)山苦荬不同萃取部位作用后，各藥物組細(xì)胞的存活率均較模型組顯著升高（P<0.01），其中正丁醇部位和水部位的活性最強（細(xì)胞存活率分別為49.3%、52.2%）。從正丁醇部位中共分離并鑒定出6個化合物，分別為苦荬菜木脂素A（Ⅰ）、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷甲酯（Ⅱ）、木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷甲酯（Ⅲ）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅳ）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅴ）和木犀草素（Ⅵ）。結(jié)論：山苦荬正丁醇部位為該藥材的保肝活性部位之一，其活性成分以黃酮類化合物為主。

關(guān)鍵詞 山苦荬;保肝活性;活性部位篩選;化學(xué)成分;鑒定

Screening of Hepatoprotective Activity Fractions from Ixeris chinensis and Study on Its Chemical Compositions

SUN Lijun1，2，3，CHANG Fuhou1，2，3，BAI Tuya1，WANG Yuhua1（1. College of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China; 2. Research Center for New Drug Screening， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China; 3. Research Center for New Drug Safety Evaluation， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China）

ABSRTACT ? OBJECTIVE： To screen the hepatoprotective active fractions from Ixeris chinensis and study its chemical constituents. METHODS： The petroleum ether， ethyl acetate， n-butanol and residual water fractions from 70% ethanol extract of I. chinensis were extracted by systematic solvent method. Human hepatocytes HL-7702 were induced by acetaminophen to induce liver injury model. MTT method was used to detect the protective effect of the above fractions （40 μg/mL， by the dosage of crude drug） on injured cells， and the active fractions were screened. The active fractions were separated and purified by silica gel column and Sephadex column chromatography. The structure of the compounds were identified by physical and chemical properties and spectral data （hydrogen spectrum， carbon spectrum）. RESULTS： After treated with different fractions of I. chinensis， the cell survival rate of each administration group was increased significantly， compared with model group （P<0.01）， and the n-butanol and water fractions had the strongest activity （the cell survival rates were 49.3% and 52.2%， respectively）. Six compounds? ? ?were isolated from n-butanol fraction and identified as sonchifolignan A （Ⅰ）， apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside methyl ester （Ⅱ）， luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside methyl ester （Ⅲ）， luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside （Ⅳ）， apigenin-7-O-β-D- glucopyranoside （Ⅴ） and luteolin （Ⅵ）. CONCLUSIONS： The n-butanol fraction is regarded as an effective position for protecting liver， and flavonoids are the main active components.

KEYWORDS? ?Ixeris chinensis; Hepatoprotective activity; Active fraction screening; Chemical components; Identification

山苦荬Ixeris chinensis （Thumb） Nakai為菊科苦荬菜屬植物[1]，蒙藥材名是蘇素-烏布斯，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載在《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)》中。山苦荬性寒、味苦，以全草入藥，多被應(yīng)用于保肝治療的方劑中，如清肝二十七味丸（蒙藥名：欽納得棍斯勒）、麥冬十三味丸（蒙藥名：查干泵阿-13）等[2]。該藥材與中華苦荬菜藥效相同，具有清熱解毒、解痙鎮(zhèn)痛、保肝護(hù)肝、涼血消腫等功效[3-4]。有研究指出，山苦荬具有明顯的抗炎保肝作用，其化學(xué)成分木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷為主要的保肝活性成分，但該藥材其余活性成分與方劑保肝活性的關(guān)聯(lián)以及保肝作用的具體機(jī)制尚未明確;此外，國內(nèi)外目前關(guān)于山苦荬基原和形態(tài)的研究較為混亂，導(dǎo)致其藥材資源缺乏有效整合，存在基原、儲量不清和代表性差等問題[5-6]。因此，本研究在前期大量論證調(diào)研、走訪蒙醫(yī)藥工作者并廣泛搜集整理蒙醫(yī)用藥經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，擬篩選山苦荬保肝活性部位，并對該活性部位的化學(xué)成分進(jìn)行解析，以期為該藥材保肝活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和作用機(jī)制闡釋提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括JEOL-AL300型核磁共振波譜儀（日本JEOL公司）、R.K.I型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Ikemoto公司）、DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀（南京華東電子集團(tuán)有限公司）、HH-S型水浴鍋和RE-SZA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、WFH-203B型三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）、TDZ4-WS型臺式低速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、BCD233型冷藏冰凍箱（青島海爾電器股份有限公司）等。

1.2 主要藥材與試劑

山苦荬全草于2017年5月采自內(nèi)蒙古赤峰，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院王素巍講師鑒定為菊科苦荬菜屬植物山苦荬I. chinensis （Thumb） Nakai;標(biāo)本保存于陰涼干燥處。

對乙酰氨基酚片（批號190811，規(guī)格0.5 g）購自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司;Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（粒徑27～163 μm）、DS-401大孔吸附樹脂（粒徑0.3～1.25 mm）均購自天津市海光化工有限公司;柱層析硅膠[粒徑分別為100～200目（拌樣）、200～300目（裝柱）]購自青島海洋化工有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)液購自德國AppliChem公司;青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、MTT試劑均購自美國Sigma公司;胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司;其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 細(xì)胞株

人正常肝細(xì)胞株HL-7702購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 山苦荬不同萃取部位的制備

采用系統(tǒng)溶劑法提取。取山苦荬全草5 kg，剪碎，裝入紗布袋中，用10倍量（L/kg）70%乙醇浸泡提取3次，每次48 h。合并提取液，減壓濃縮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取1次，萃取溶劑與濃縮液的體積比均為2 ∶ 1。將各溶劑萃取液溶劑回收后，分別得石油醚萃取部位（52 g）、乙酸乙酯萃取部位（27 g）、正丁醇萃取部位（133 g）以及剩余水部位（209 g）。稱取上述4種萃取部位適量，用5‰DMSO溶液溶解，然后用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋，制得最終質(zhì)量濃度均為40 μg/mL（以生藥量計）的萃取部位藥液，置于4 ℃冰箱中保存，以備后續(xù)保肝活性篩選實驗所用。

2.2 山苦荬保肝活性部位的篩選

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的HL-7702細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋，制得密度為5×104 mL-1的單細(xì)胞懸液，按每孔0.1 mL接種于96孔板中，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中（以下培養(yǎng)條件相同）培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為DMSO對照組（不含藥物、只含5‰DMSO溶液）、正常組（不含藥物、也不含DMSO）、模型組（對乙酰氨基酚2 mg/mL，劑量設(shè)置參考本課題組前期實驗結(jié)果）和各萃取部位組（40 μg/mL，均以生藥量計，劑量設(shè)置參考本課題組前期實驗結(jié)果），每組均設(shè)置6個復(fù)孔。各組細(xì)胞加入上述對應(yīng)藥液或5‰DMSO溶液后，培養(yǎng)24 h，每孔加入0.5 mg/mL MTT試劑20 ?L;繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入DMSO 150 ?L，振蕩10 min。使用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值并計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（實驗組平均OD值/正常組平均OD值）×100%[7-8]。實驗重復(fù)6次。

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。山苦荬各萃取部位對肝細(xì)胞存活率的影響見表1。由表1可見，與正常組比較，DMSO對照組細(xì)胞存活率無顯著變化（P>0.05），提示以5‰DMSO溶液溶解樣品對細(xì)胞影響不大;與正常組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01），提示2 mg/mL對乙酰氨基酚可導(dǎo)致人正常肝細(xì)胞損傷;與模型組比較，山苦荬各萃取部位組細(xì)胞的存活率均顯著升高（P<0.01），其存活率大小依次為剩余水部位組>正丁醇萃取部位組>乙酸乙酯萃取部位組>石油醚萃取部位組，提示山苦荬不同萃取部位對人肝細(xì)胞損傷均有一定的保護(hù)作用。

2.3 山苦荬保肝活性部位化學(xué)成分的分離鑒定

2.3.1 正丁醇萃取部位的分離純化

參考“2.2”項下結(jié)果，本課題組先針對活性較高、極性相對適中的正丁醇萃取部位進(jìn)行化學(xué)成分分離，剩余水部位的化學(xué)成分研究尚在進(jìn)行中（擬后續(xù)另文報道）。取正丁醇萃取物133 g，經(jīng)DS-401大孔吸附樹脂柱粗分離后，以水-甲醇（100 ∶ 0～0 ∶ 100，V/V）梯度洗脫，再經(jīng)薄層色譜（TLC）鑒別后，得30%、50%、70%、90%甲醇和水洗脫物。各洗脫部位經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離，以不同比例氯仿-甲醇-水進(jìn)行洗脫，再借助Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱純化、重結(jié)晶、TLC鑒別等方法，得到8個化合物。其中，從50%甲醇洗脫物中分離得化合物Ⅰ（18 mg）、Ⅱ（20 mg）、Ⅶ（15 mg）;從70%甲醇洗脫物中分離得化合物Ⅲ（23 mg）、Ⅳ（22 mg）、Ⅴ（18 mg）;從90%甲醇洗脫物中分離得到化合物Ⅵ（14 mg）、Ⅷ（6 mg）[9]。具體分離流程圖見圖1。

2.3.2 山苦荬正丁醇萃取部位化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)理化性質(zhì)和波譜（氫譜、碳譜）數(shù)據(jù)分析鑒定山苦荬正丁醇萃取部位的活性成分（由于化合物Ⅶ、Ⅷ量少，無法有效鑒定，本文略去）。

化合物Ⅰ：白色粉末，分子式為C26H36O12。FeCl3反應(yīng)陽性，提示為酚類化合物;酸水解檢出葡萄糖。1H- NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：7.38（1H，d，J=8.1 Hz，H-7），7.23（1H，d，J=8.1 Hz，H-6），5.61（1H，d，J=3.9 Hz，H-8），6.87（1H，s，H-2′），6.74（1H，d，J=8.1 Hz，H-6′），4.83（1H，d，J=7.5 Hz，H-9′）。13C-NMR（DMSO- d6，500 MHz）δ：120.1（C-2），148.2（C-3），146.3（C-4），116.5（C-5），111.5（C-6），73.6（C-7），85.7（C-8），61.4（C-9），136.5（C-1′），113.6（C-2′），150.0（C-3′），147.1（C-4′），118.1（C-5′），121.7（C-6′），100.9（C-1″），74.1（C-2″），77.4（C-3″），71.5（C-4″），77.2（C-5″），61.9（C-6″）。上述結(jié)果與文獻(xiàn)[10]報道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物Ⅰ為苦荬菜木脂素A（Sonchifolignan A）。

化合物Ⅱ：黃色針晶，分子式為C22H20O11。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，Molish反應(yīng)陽性，提示為黃酮苷類化合物。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：13.0（1H，s，5- OH），7.78（2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，H-6′），6.93（2H，d，J=8.7 Hz，H-3′，H-5′），6.65（1H，s，H-3），6.79（1H，d，J=1.8 Hz，H-8），6.48（1H，d，J=1.8 Hz，H-6），5.18（1H，d，J=6.9 Hz，GlcA-H-1）。13C-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：164.7（C-2），103.3（C-3），182.0（C-4），161.0（C-5），99.4（C-6），162.8（C-7），94.8（C-8），158.3（C-9），105.3（C-10），121.5（C-1′），126.6（C-2′），116.0（C-3′），161.1（C-4′），115.8（C-5′），128.2（C-6′），99.5（C-1″），73.1（C-2″），76.4（C-3″），71.5（C-4″），75.2（C-5″），169.9（C-6″）。上述結(jié)果與文獻(xiàn)[10]報道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物Ⅱ為芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷甲酯（Apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside methyl ester）。

化合物Ⅲ：黃色顆粒，分子式為C22H20O12。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，Molish反應(yīng)陽性，提示為黃酮苷類化合物。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：13.0（1H，s，5- OH），7.45（1H，dd，J=8.1，1.5 Hz，H-6′），7.43（1H，d，J=1.5 Hz，H-2′），6.91（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），6.82（1H，d，J=1.5 Hz，H-8），6.77（1H，s，H-3），6.47（1H，d，J=1.5 Hz，H-6），5.04（1H，d，J=6.9 Hz，GlcA-H-1）。13C-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：164.7（C-2），103.1（C-3），182.6（C-4），157.0（C-5），99.2（C-6），163.1（C-7），94.8（C-8），161.3（C-9），105.3（C-10），121.7（C-1′），113.6（C-2′），146.0（C-3′），150.1（C-4′），115.8（C-5′），120.2（C-6′），99.9（C-1″），73.1（C-2″），77.4（C-3″），69.5（C-4″），77.2（C-5″），60.9（C-6″）。上述結(jié)果與文獻(xiàn)[10]報道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物Ⅲ為木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷甲酯（Luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside methyl ester）。

化合物Ⅳ：黃色粉末，分子式為C21H20O11。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，提示為黃酮類化合物。1H-NMR（DMSO- d6，500 MHz）δ：7.45（1H，dd，J=8.4，2.3 Hz，H-6′），7.41（1H，d，J=2.3 Hz，H-2′），6.90（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.78（1H，d，J=2.I Hz，H-8），6.76（1H，s，H-3），6.44（1H，d，J=2.1 Hz，H-3）。13C-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：164.7（C-2），103.3（C-3），182.2（C-4），157.0（C-5），99.5（C-6），163.0（C-7），94.8（C-8），161.4（C-9），105.3（C-10），120.7（C-1′），113.6（C-2′），150.0（C-3′），147.1（C-4′），116.2（C-5′），121.7（C-6′），99.9（C-1″），73.1（C-2″），76.4（C-3″），69.5（C-4″），77.2（C-5″），60.9（C-6″）。結(jié)合文獻(xiàn)[5，10-11]報道的數(shù)據(jù)，故鑒定化合物Ⅳ為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（Luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside）。

化合物Ⅴ：淡黃色針狀結(jié)晶，分子式為C21H20O10。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，Molish反應(yīng)為陽性，提示為黃酮苷類化合物;可見光下TLC檢視可見黃色斑點。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：12.97（1H，s，5-OH），7.94（2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′），6.91（2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′），6.85（1H，s，H-3），6.82（1H，d，J=1.8 Hz，H-8），6.43（1H，d，J=1.8 Hz，H-6），5.06（1H，d，J=7.2 Hz，H-1″），3.69（1H，d，J=8.4 Hz，H-6″）。13C-NMR（DMSO- d6，500 MHz）δ：164.3（C-2），102.9（C-3），182.0（C-4），163.1（C-5），99.5（C-6），163.0（C-7），94.8（C-8），157.1（C-9），105.3（C-10），120.7（C-1′），128.6（C-2′，-6′），116.0（C-3′，5′），161.1（C-4′），99.9（C-1″），73.1（C-2″），76.4（C-3″），69.5（C-4″），77.2（C-5″），60.6（C-6″）。上述結(jié)果與文獻(xiàn)[5，10]報道數(shù)據(jù)基本一致，故確定化合物Ⅴ為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（Apigenin-O-β-D-glucopyranoside）。

化合物Ⅵ：黃色針晶，分子式為C15H10O6。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性;紫外燈下GF254 TLC板顯暗斑。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：12.96（1H，s，5-OH），7.41（1H，brs，H-6′），7.39（1H，brs，H-2′），6.87（1H，d，J=7.2 Hz，H-5′），6.66（1H，s，H-3），6.43（1H，d，J=1.8 Hz，H-8），6.17（1H，d，J=1.8 Hz，H-6）。13C-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：163.8（C-2），102.8（C-3），181.6（C-4），157.2（C-5），98.8（C-6），164.1（C-7），93.8（C-8），161.4（C-9），103.6（C-10），121.5（C-1′），113.3（C-2′），145.7（C-3′），149.7（C-4′），116.0（C-5′），119.0（C-6′）。上述結(jié)果與文獻(xiàn)[5-6]報道數(shù)據(jù)基本一致，故確定化合物Ⅵ為木犀草素（Luteolin）。

3 討論

本課題組前期初步研究了山苦荬的體外抗腫瘤活性，考察該藥材不同提取物在不同質(zhì)量濃度（5 000、? ? ? 1 000、200、40、8 μg/mL，均以生藥量計）下對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的影響。結(jié)果顯示，在較低的質(zhì)量濃度40 μg/mL下，山苦荬石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位和剩余水部位對細(xì)胞的影響均表現(xiàn)出了明顯差異，故本研究以40 μg/mL為給藥濃度進(jìn)行山苦荬保肝活性部位的篩選。

本研究從山苦荬70%乙醇提取物中依次得到極性由小到大的5個萃取部位，即石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位和剩余水部位。MTT實驗結(jié)果顯示，山苦荬保肝活性部位主要集中在正丁醇萃取部位和剩余水部位?；诨瘜W(xué)成分極性特征，本研究以山苦荬正丁醇萃取部位為研究對象，運用硅膠柱層析、Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱層析、重結(jié)晶等方法對其進(jìn)行分離純化，得到8個單體化合物;借助理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)將其中6個化合物（Ⅰ～Ⅵ）依次鑒定為苦荬菜木脂素A、木犀草素、木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷甲酯、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷甲酯。

值得注意的是，本研究在對山苦荬正丁醇部位進(jìn)行分離純化時發(fā)現(xiàn)，其大孔吸附樹脂30%甲醇洗脫部分也具有一定的保肝活性，但未能分離到單體化合物;此外，在后續(xù)的初步活性評價中，本課題組發(fā)現(xiàn)1×10-5 mol/L的木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷具有明顯的保肝活性，可能是山苦荬的保肝活性單體，但有待進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本研究對山苦荬乙醇提取物進(jìn)行了保肝活性部位篩選，并對活性部位的化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，初步確定其正丁醇部位為該藥材保肝活性部位之一，活性成分以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷等黃酮類化合物為主。本研究雖為山苦荬的保肝物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)，但為了進(jìn)一步充分利用山苦荬植物資源、挖掘具有保肝活性的蒙藥單體成分，有必要進(jìn)行更為深入的系統(tǒng)研究。

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（收稿日期：2020-08-04 修回日期：2020-12-14）

（編輯：張元媛）