炒地龍與地龍飲片中次黃嘌呤和肌苷含量的比較

孫立麗，霍秦秦，王婉婷

（吉林市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 吉林）

0 引言

炒地龍為地龍的清炒炮制加工品。炒地龍照炒炙法（《中國(guó)藥典》2015 版 四部 通則0213）清炒炮制。

地龍的來(lái)源有廣地龍和滬地龍，廣地龍主產(chǎn)于廣東、海南、廣西，春季至秋季捕捉；滬地龍主產(chǎn)于浙江、江蘇、上海、山東、河南等地[1]?，F(xiàn)省內(nèi)制藥企業(yè)、藥品批發(fā)、市售及醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用的地龍藥材均為廣地龍，滬地龍較少見。

化學(xué)成分：地龍?bào)w內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)類、多肽類、核苷酸、氨基酸以及脂肪酸等化學(xué)成分[2]。蛋白質(zhì)是地龍的主要活性成分之一；多肽類包括活性地龍肽和抗菌肽等；核苷酸是地龍代謝的重要化學(xué)成分，地龍中主要有次黃嘌呤、黃嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶等核苷酸成分；地龍含有多種氨基酸，包括了人體必需的八種氨基酸。

藥理作用： 生地龍主要有平喘、抗凝血、抗血栓、抗腫瘤、降血壓等藥理作用，所含的蚯蚓解熱堿具有良好的解熱作用。地龍的平喘降壓作用，主要是含有次黃嘌呤、黃嘌呤等核苷酸成分, 并有抗組織胺及舒張支氣管作用，從而達(dá)到止咳平喘的目的[3]。

1 樣品收集

起草樣品收集情況：共收集地龍2 個(gè)品種10 批次藥材，其中廣地龍8 批、滬地龍2 批，來(lái)自廣西、河北、海南、廣東、江蘇、安徽等10 個(gè)產(chǎn)地。

2 含量測(cè)定

地龍主要活性成分有肌苷、次黃嘌呤、琥珀酸等。肌苷又可稱為次黃嘌呤核苷，它在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與次黃嘌呤極為相似，僅比次黃嘌呤多了一個(gè)呋喃糖。

參照有關(guān)文獻(xiàn)[5，6]采用高效液相色譜法對(duì)炒地龍中肌苷、次黃嘌呤進(jìn)行含量測(cè)定。

2.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Waters e2695；電子天平METTLER MS105DΜ， 電子天平JA5003；

肌苷對(duì)照品，批號(hào)：140669-201104，含量100%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

次黃嘌呤對(duì)照品，批號(hào)：140661-201704，含量100%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2.2 方法考察

方法：采用高效液相色譜法以次黃嘌呤和肌苷為定量指標(biāo)，進(jìn)行含量測(cè)定[7]，對(duì)10 批地龍樣品炮制前后進(jìn)行含量考察。

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色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.01mol/L 磷酸二氫鉀溶液—50%甲醇溶液（80 ∶20）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；柱溫30℃；流速0.8ml/min；進(jìn)樣量20μl。

對(duì)照品溶液與供試品溶液制備:

對(duì)照品溶液的制備:取次黃嘌呤對(duì)照品與肌苷對(duì)照品適量，精密稱定，置同一100ml 量瓶中，加0.9%氯化鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置20ml 量瓶中，加0.9%氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml 中含次黃嘌呤對(duì)照品25μg、肌苷對(duì)照品50 μg 的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.9%氯化鈉溶液25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定重量，用0.9%氯化鈉溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心10min（4000r/min），精密量取上清液5ml,置10ml 量瓶中，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液20μl 注入液相色譜儀，測(cè)定。

3 方法學(xué)考察結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱取次黃嘌呤對(duì)照品10.24mg、肌苷對(duì)照品20.70mg，置同一100ml 量瓶中，加0.9%氯化鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5ml，置20ml 量瓶中，加0.9%氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液5、10、15、20、25μl，分別注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積，以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果次黃嘌呤回歸方程為Y=5392.9X-38420 r ≈1.0000，進(jìn)樣量在128-640ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

肌苷回歸方程為 Y=2822.3X-34021 r ≈1.0000，進(jìn)樣量在258.75-1293.75ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見表1、表2。

表1 次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

表2 肌苷標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

3.2 儀器精密度試驗(yàn)

取同一供試品（CDL-06）溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次20μl，依法測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果見表3。

次 黃 嘌 呤 平 均：682233，RSD=1.2%；肌 苷 平 均：1663696，RSD=1.5%

結(jié)果表明精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性考察

取同一供試品（CDL-06）溶液，分別在0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h 各進(jìn)樣測(cè)定一次，記錄峰面積。結(jié)果見表4。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

次黃嘌呤平均值：722540，RSD=5.7%，肌苷平均值：1716031，RSD=2.8%。

結(jié)果表明：供試品溶液在24h 內(nèi)次黃嘌呤相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，穩(wěn)定性較差。

3.4 重復(fù)性考察

取同一批供試品（CDL-06）6 份，依法測(cè)定，平行測(cè)定6 次，計(jì)算。結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果次黃嘌呤平均含量為545.98 μg/g，RSD 為1.5%；肌苷平均含量為2.76mg/g，RSD 為2.2%，表明本方法重復(fù)性較好。

3.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取已知含量的樣品（CDL-06）（含次黃嘌呤520.55 μg/g、肌苷2.80 mg/g）6 份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品混合溶液（次黃嘌呤0.02496mg/ml、肌苷0.1457mg/ml）5ml，分別精密加0.9%氯化鈉溶液適量，使總體積至25ml，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果次黃嘌呤平均回收率為95.9%，RSD=5.6%，肌苷平均回收率為93.0%，RSD=4.8%，n=6。結(jié)果見表6、表7。

表6 次黃嘌呤回收率試驗(yàn)結(jié)果

表7 肌苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表8 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 樣品測(cè)定

10 批樣品測(cè)定結(jié)果：依法測(cè)定地龍炮制前、后樣品中次黃嘌呤和肌苷含量，結(jié)果見表8。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：地龍10 批生品含量次黃嘌呤在 262.566-632.371μg/g 之 間，均 值450.28μg/g 、肌 苷 在1.820-3.560mg/g 之間，均值2.30 mg/g，炒地龍10 批含量次黃嘌呤在282.703- 658.166μg/g 之間，均值479.08μg/g 、肌苷在1.381- 2.804 mg/g 之間，均值1.96mg/g。地龍10 批炒制前后含量均有變化，炒地龍次黃嘌呤的含量相應(yīng)增高、肌苷含量相應(yīng)降低。

5 討論

地龍經(jīng)過(guò)炮制后化學(xué)成分或多或少會(huì)有一些變化。如炒制地龍中肌苷含量較生品相應(yīng)降低，而次黃嘌呤含量增高，平喘療效增強(qiáng)；炮制品較地龍生品中蚓激酶的含量會(huì)減少[8]。