Ⅰ群禽腺病毒分離鑒定及penton基因序列分析

王彩先 陸冰洋 劉華棟 李婷婷 唐娟 丁樹榮

摘要：為調(diào)查山西省Ⅰ群禽腺病毒感染狀況，2018—2020年從山西各地區(qū)雞場采集樣品204份，通過SPF雞胚傳代增殖，設(shè)計檢測引物及penton基因全序列引物，經(jīng)PCR鑒定，選取陽性毒株進(jìn)行免疫瓊脂擴(kuò)散試驗、致細(xì)胞病變和雞胚致病性試驗。結(jié)果顯示：60份為Ⅰ群禽腺病毒陽性，陽性率為29.4%（60/204），從60份陽性Ⅰ群禽腺病毒中選取8株病毒與Ⅰ群禽腺病毒陽性血清反應(yīng)，均呈現(xiàn)陽性；并且都可以導(dǎo)致雞胚肝細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，增強(qiáng)其折光性；雞胚試驗可致雞胚發(fā)育不良或致死，有明顯病變發(fā)生。將克隆的8株penton基因進(jìn)行序列分析比對及遺傳進(jìn)化分析，顯示與Ⅰ群禽腺病毒血清1型和血清4型親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)99.6%～100%，其中6株為血清1型，2株為血清4型；與Ⅰ群禽腺病毒其它血清型同源性達(dá)72.0%～75.8%，與Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒同源性為49.0%～52.8%。研究提示，Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于養(yǎng)殖群體中，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對Ⅰ群禽腺病毒的檢測和免疫，防治其它傳染病的繼發(fā)感染，以提高動物生產(chǎn)的安全。

關(guān)鍵詞：Ⅰ群禽腺病毒；分離鑒定；penton基因

禽腺病毒（fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）歸屬于腺病毒科腺病毒屬，Ⅰ群禽腺病毒為線狀雙鏈DNA病毒[1-3]，具有共同的抗原，禽腺病毒顆粒呈球形，具有12個定點，直徑為70～90nm，無囊膜，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，由纖突（faber）、芯髓（cora）、衣殼（capsid）及相關(guān)蛋白構(gòu)成表面的252個殼粒，殼粒可以分成六鄰體（hexon）、五鄰體（penton），每個五鄰體連接兩根纖毛（fiber-1、fiber-2）[4-9]。其中penton所在的頭節(jié)區(qū)能夠識別細(xì)胞表面的病毒受體，在病毒入侵細(xì)胞的過程中起著非常重要的作用[10]。Ⅰ群禽腺病毒包括傳統(tǒng)的禽腺病毒及其他禽類分離物，可以水平傳播、垂直傳播、污染雞胚。該病多數(shù)呈隱性感染，在動物體內(nèi)復(fù)制不發(fā)病，當(dāng)動物抵抗力降低時隨同其他疾病共同發(fā)病，且影響動物免疫功能。近年出現(xiàn)其他Ⅰ群禽腺病毒具有強(qiáng)致病性，死亡率可達(dá)60%[11-13]。

本試驗對采集樣品進(jìn)行免疫瓊脂擴(kuò)散試驗、血凝試驗、致細(xì)胞病變和雞胚致病性試驗及PCR檢測，對病毒penton基因序列進(jìn)行分析比對。根據(jù)該基因建立起來的PCR診斷方法可用于Ⅰ群禽腺病毒的鑒定。

1材料與方法

1.1材料及試驗動物

SPF雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，雛雞均由SPF雞胚孵化；Ⅰ群禽腺病毒、減蛋綜合征（EDSV）、新城疫病毒（NDV）、禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽流感H9亞型（AIV-H9）、禽傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）陽性血清和SPF雞陰性血清由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院提供。

1.2主要試劑

E.coli DH5α菌株、病毒基因組DNA抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、DMEM、胎牛血清，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；pMD18-T克隆載體、Premix Taq，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3病毒的分離

取采集樣品，60Hz、10min研磨，反復(fù)凍融3次后，6，000r/min離心5min，取上清液過0.22μm濾菌器。采用尿囊腔接種法接種于9～10日齡SPF雞胚，每枚SPF雞胚接種200μL，棄24h內(nèi)死亡雞胚，溫育120h，將全部SPF雞胚放入4℃、6h，收獲尿囊液，連續(xù)3次傳代后收集的尿囊液用于DNA提取，提取方法參照病毒基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4引物設(shè)計

根據(jù)GeneBank公布的FAdV-4中hexon和penton基因序列[14，15]，設(shè)計hexon檢測引物，分別是text-F/text-R，預(yù)期片段大小為421bp；設(shè)計penton的測序引物，分別是penton-1F/penton-1R，預(yù)期片段大小為1，834bp，penton-4F/penton-4R，預(yù)期片段大小為1，759bp，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.5樣品PCR檢測

PCR擴(kuò)增體系（總體積為25μL）：Premix Taq 20μL，DNA模板3μL，text-F/text-R各1μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10min。取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 penton基因的克隆

1.5中PCR檢測為禽腺病毒陽性的毒株中，選取8株進(jìn)行PCR，擴(kuò)增體系（總體積為25μL）：Premix Taq 20μL，DNA模板3μL，上下游引物各1μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10min；95℃變性 30s，55℃/56℃退火 30s，72℃延伸 30s，共 30 個循環(huán)；72℃再延伸 10min。取 5μ L PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收，將膠回收產(chǎn)物連接 pMD18-T 克隆載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH 5α ，經(jīng) 37℃培養(yǎng) 24h 后，挑取單菌落，經(jīng) PCR 鑒定，陽性菌送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果使用 DNAstar 進(jìn)行序列比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.7 免疫瓊脂擴(kuò)散試驗

經(jīng) 1.5 中 PCR 鑒定為陽性的禽腺病毒毒株中，選取8 株不同年份的禽腺病毒毒株，制備抗原，按照常規(guī)方法進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗，用Ⅰ群禽腺病毒陽性血清與 8 株禽腺病毒抗原互相作用，Ⅰ群禽腺病毒陽性血清與減蛋綜合征（EDSV）、新城疫病毒（NDV）、禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽流感 H9 亞型（AIV-H9）、禽傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）陽性血清和 SPF 雞陰性血清互相作用為對照

1.8 SPF雞胚肝細(xì)胞制備及病變

按照制備原代雞胚肝細(xì)胞方法將 15～16d SPF 雞胚的肝組織用 0.25%胰酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM作為培養(yǎng)基，放置在 CO2 培養(yǎng)箱中以 37℃，5%CO2 培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)長成至單層后，取 2mL 分離上清液接種 SPF 雞胚肝細(xì)胞，經(jīng)2h 感染后棄去分離物，加入 20mL 5%胎牛血清維持液，同時設(shè)置未接種分離物SPF雞胚肝細(xì)胞為陰性對照，12h 后觀察培養(yǎng)情況，以后每3h 觀察一次。

1.9 雞胚致病性試驗

8株禽腺病毒分離物上清液分別接種9～10d SPF雞胚48枚，每株6枚，每枚SPF雞胚接種200μL設(shè)置空白對照6枚。37℃孵育培養(yǎng)，分別于72h、96h、120h觀察雞胚的生長情況和病變情況。

2結(jié)果與分析

2.1樣品PCR檢測

經(jīng)病毒基因組DNA提取試劑盒提取盲傳3代增殖尿囊液的DNA，經(jīng)PCR鑒定，在204份樣品中，60份為Ⅰ群禽腺病毒陽性，陽性率為29.4%（60/204），部分樣品的PCR結(jié)果見圖1。

2.2 penton基因的克隆

分別以8株陽性禽腺病毒上清液提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出1，736bp片段，與預(yù)期目標(biāo)相符，陰性對照pMD-18T載體質(zhì)粒中未能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，PCR結(jié)果見圖2。

2.3 penton基因的序列比較和進(jìn)化樹分析

使用DNAStar軟件對8株1，759bp的penton基因序列進(jìn)行分析。其中FAV-01和FAV-03與Ⅰ群禽腺病毒血清4型同源性分別為100%與99.8%，其余6株陽性禽腺病毒毒株與Ⅰ群禽腺病毒血清1型同源性為99.6%～99.9%，所有的8株陽性禽腺病毒毒株與Ⅰ群禽腺病毒其他血清型同源性為72.0%～75.8%，與Ⅱ群禽腺病毒HEV（Turkey adenovirus 3 strain CA-AB）的同源性為49.0%～50.4%，與Ⅲ群禽腺病毒EDSV（Duck adenovirus 1 strain D11-JW-012）的同源性為50.9%～52.8%，見圖3。

遺傳進(jìn)化樹分析顯示，F(xiàn)AV-01與FAV-03與Ⅰ群禽腺病毒血清4型親緣關(guān)系最近，其余6株陽性禽腺病毒毒株與Ⅰ群禽腺病毒血清1型親緣關(guān)系最近，所有的8株陽性禽腺病毒毒株與Ⅰ群禽腺病毒其他血清型親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，與Ⅱ群禽腺病毒HEV和Ⅲ群禽腺病毒EDSV屬于不同進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，見圖4。

2.4瓊脂擴(kuò)散試驗結(jié)果

8株陽性禽腺病毒上清液與Ⅰ群禽腺病毒陽性血清均出現(xiàn)特異性白色沉淀帶，而減蛋綜合征（EDSV）、新城疫病毒（NDV）、禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽流感H9亞型（AIV-H9）、禽傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）陽性血清和SPF雞陰性血清均不能與Ⅰ群禽腺病毒陽性血清產(chǎn)生特異性白色沉淀帶。

2.5細(xì)胞病變結(jié)果

8株陽性禽腺病毒上清液接種SPF雞胚肝細(xì)胞，雞胚肝細(xì)胞12h后逐漸開始出現(xiàn)變圓、皺縮，24h后集聚成堆、脫落、遮光性增強(qiáng)、細(xì)胞間距增大，呈拉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的病變特征；而對照組的雞胚肝細(xì)胞無相似病變特征。

2.6雞胚致病性試驗

8株陽性禽腺病毒上清液接種SPF雞胚后72h無死亡產(chǎn)生，每株禽腺病毒4℃冷凍2枚，共計16枚可觀察到全部SPF雞胚均出現(xiàn)尿囊液渾濁，有大量尿酸鹽產(chǎn)生，部分胚胎發(fā)育不良，呈侏儒胚，有出血癥狀，肝臟無明顯病變，絨毛尿囊膜增厚，陰性對照胚體發(fā)育正常無病變；96h后無死亡產(chǎn)生，每株禽腺病毒4℃冷凍2枚，共計16枚，病變情況與72h相似，出血雞胚組織松軟，取出時容易撕開斷裂；120h有1枚SPF雞胚死亡，觀察剩余16枚雞胚，病變情況與72h相似，死亡雞胚出現(xiàn)溶解樣病變，肝臟呈土黃色無出血點。各階段對照組SPF雞胚均發(fā)育正常。

3討論

Ⅰ群禽腺病毒對禽類的致病性主要引起的疾病有心包積液綜合征（HPS）和包涵體肝炎（IBH）[16，17]，本試驗從采集的204份樣品中，經(jīng)SPF雞胚傳代增殖及PCR鑒定，確定60份樣品為Ⅰ群禽腺病毒陽性，陽性率為29.4%（60/204），可見Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于健康雞群中，呈現(xiàn)感染率較高，并且發(fā)病率低于感染率。Ⅰ群禽腺病毒感染雞群通常沒有明顯的臨床癥狀，并且可以垂直傳播。但是根據(jù)Ⅰ群禽腺病毒毒力的不同也可引起包肝炎和心包積液綜合征，主要臨床表現(xiàn)為心包腔內(nèi)充滿大量黃色透明液體或膠胨狀物質(zhì)，肝臟腫大出血，脾臟腫大出血，腎臟腫大出血伴有尿酸鹽沉積，腺胃和肌胃交界出血，偶有肺臟出血發(fā)生。

由于Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于健康禽類之中[18]，如雞、鴨、鵝等，卻不表現(xiàn)明顯的致病特征和臨床癥狀，極易在養(yǎng)殖生產(chǎn)中被忽略，由于該病垂直傳播，隱性污染雞胚的可能性被提高，加之部分生物制品中仍無法完全使用SPF雞胚或者是免疫雞胚，在生產(chǎn)過程中依賴非免疫雞胚，使得Ⅰ群禽腺病毒污染生物制品的情況發(fā)生，嚴(yán)重影響胚源生物制品的質(zhì)量。

8株陽性Ⅰ群禽腺病毒毒株經(jīng)序列同源性比較和進(jìn)化樹分析，penton基因與已報道的Ⅰ群禽腺病毒血清1型和血清4型序列同源性達(dá)99.6%～100%，與其他Ⅰ群禽腺病毒血清型同源性達(dá)72.0%～75.8%，與Ⅱ群禽腺病毒HEV同源性為49.0%～50.4%，與Ⅲ群禽腺病毒EDSV同源性為50.9%～52.8%；進(jìn)化樹分析確定8株陽性毒株其中6株陽性與Ⅰ群禽腺病毒血清1型接近，2株陽性與血清4型接近，8株陽性與Ⅰ群禽腺病毒其他血清型較遠(yuǎn)，而與Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，屬于不同的進(jìn)化支，表明8株陽性毒株均歸屬于Ⅰ群禽腺病毒。

Ⅰ群禽腺病毒雖然只有少數(shù)血清型能夠引起明顯發(fā)病，但當(dāng)雞群受到其他禽類傳染病的侵害時可以產(chǎn)生協(xié)同作用，如雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）和雞傳染性貧血病毒（CIAV）[19-21]，可使條件性致病源發(fā)生快速感染，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受到侵害，引起產(chǎn)蛋下降、再生障礙性貧血和死亡等癥狀，應(yīng)當(dāng)對Ⅰ群禽腺病毒予以重視，防止大規(guī)模疾病發(fā)生。

4結(jié)論

本試驗分離到60株FAV，多數(shù)陽性毒株采集于無癥狀雞群，表明FAV在雞群中呈陰性感染狀態(tài)，應(yīng)當(dāng)采取血清學(xué)檢測或者是分子生物學(xué)檢測，以指導(dǎo)雞場采用疫苗或者淘汰的方法進(jìn)行凈化，經(jīng)PCR鑒定及序列測定毒株仍未有更詳盡的研究，將會對其進(jìn)行更深入的探討。█

參考文獻(xiàn)：

[1]牛登云，沈元，王蕊，等.2015年我國Ⅰ群禽腺病毒分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國家禽，2016，38（9）：65-68.

[2] Adair B M， Fitzgerald S D. Group 1 adenovirus infections [J]. Diseases of poultry， 2008， 12： 251-266.

[3] Hess M. Aviadenovirus infections [J]. Diseases of poultry， 2013： 290-300.

[4] Fitzgerald S D， Rautenschlein S， Mahsoub H M， et al. Adenovirus infections[J]. Diseases of poultry， 2020： 321-363.

[5]徐丹.FAdV-4 pcDNA3.1-Penton重組質(zhì)粒的構(gòu)建及免疫原性的初步探究[D].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[6] Shah M S， Ashraf A， Khan M I， et al. Fowl adenovirus： history， emergence， biology and development of a vaccine against hydropericardium syndrome [J]. Archives of virology， 2017， 162 （7）： 1833-1843.

[7] Akopian T A， Lazareva S E， Tikhomirov E E， et al. Genes for fowl adenovirus CELO penton base and core polypeptides [J]. Archives of virology， 1996， 141（2）： 357-365.

[8] Park H S， Lim I S， Kim S K， et al. Molecular analysis of the hexon， penton base， and fiber-2 genes of Korean fowl adenovirus serotype 4 isolates from hydropericardium syndrome-affected chickens [J]. Virus Genes， 2017， 53（1）： 111-116.

[9]王馨培. 遼寧地區(qū)野禽 FAdV-4 感染的調(diào)查及其 Penton 基因序列分析[D].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[10] Liu Y， Wan W， Gao D， et al. Genetic characterization of novel fowl aviadenovirus 4 isolates from outbreaks of hepatitis-hydropericardium syndrome in broiler chickens in China [J]. Emerging microbes & infections， 2016， 5（1）： 1-8.

[11] 高輝，張夢荷，馮茹，等.Ⅰ群禽腺病毒 4 型 Penton 基因的克隆及原核表

達(dá)[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2018，39（5）：1-5.

[12] 程昊.2015-2017 年禽腺病毒的分離鑒定及分別表達(dá)禽腺病毒 penton和 fiber2 蛋白重組新城疫病毒的構(gòu)建[D].揚州大學(xué)，2018.

[13] 張夢荷. Ⅰ群禽腺病毒血清 4 型 PCR 檢測方法的建立及 Penton 蛋白的原核表達(dá)[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2018.

[14] Matczuk A K， Niczyporuk J S， Kuczkowski M， et al. Whole genome sequencing of Fowl aviadenovirus A-a causative agent of gizzard erosion and ulceration， in adult laying hens[J]. Infection， Genetics and Evolution， 2017， 48： 47-53.

[15] Vera-Herná ndez P F， Morales-Garzón A， Cortés-Espinosa D V， et al. Clinicopathological characterization and genomic sequence differences observed in a highly virulent fowl Aviadenovirus serotype 4[J]. Avian Pathology， 2016， 45（1）： 73-81.

[16] Hess M， Bl？cker H， Brandt P. The complete nucleotide sequence of the egg drop syndrome virus： an intermediate between mastadenoviruses and aviadenoviruses[J]. Virology， 1997， 238 （1）： 145-156.

[17] Jucker M T， McQuiston J R， Van Den Hurk J V， et al. Characterization of the haemorrhagic enteritis virus genome and the sequence of the putative penton base and core protein genes[J]. Journal of general virology， 1996， 77（3）： 469-479.

[18] Aziz F， Tufail S， Shah M A， et al. In silico epitope prediction and immunogenic analysis for penton base epitope-focused vaccine against hydropericardium syndrome in chicken [J]. Virus research， 2019， 273： 197750.

[19] Kim J I， Oh S J， Lee I， et al. Evolutionary relationships of the hexon and penton base genes of novel squirrel adenovirus [J]. Molecular phylogenetics and evolution， 2017， 116： 25-29.

[20] McCoy R J， Johnson M A， Studdert M J， et al. Genomic location and nucleotide sequence of a porcine adenovirus penton base gene[J]. Archives of virology， 1996， 141（7）： 1367-1375.

[21] Saif Y M， Barnes H， Glisson J R， et al. Diseases of poultry. 12th ed. Ames： Iowa State University Press， 2008： 289-329.