生防菌解淀粉芽孢桿菌B15發(fā)酵液抗菌譜及安全性測試

張鳳杰 金瑋鋆 張曉蒙 于佳俊 鄒理 孫寶勝 閆寅卓 薛潔

摘要：解淀粉芽孢桿菌B15是來源于釀酒葡萄表面的生防菌，通過研究該菌株發(fā)酵液對(duì)23種植物病原菌的抑制效果，并以水稻為試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行安全性測試。結(jié)果表明，生防菌解淀粉芽孢桿菌B15的發(fā)酵稀釋液（濃度為 10 CFU/mL）對(duì)23種植物病原菌的抑制率均在50%以上，對(duì)香菇爛筒病、蘋果腐爛病、棉花炭疽病、花生褐斑病和黃瓜枯萎病5種病原真菌的抑制率在90%以上，計(jì)算可得EC50的范圍為0.000～11.704 個(gè)/mL，表明解淀粉芽孢桿菌B15具有廣譜抗菌性。通過室內(nèi)田間安全測試試驗(yàn)，驗(yàn)證了該菌株對(duì)作物的安全性，從而為該菌株生物農(nóng)藥的開發(fā)與應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;植物病原菌;抑制率;抗菌譜;安全性測試

中圖分類號(hào)： TQ458;S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）05-0102-05

筆者所在實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中，從釀酒葡萄表面篩選、鑒定發(fā)現(xiàn)1株具有明顯抑制霉菌效果的解淀粉芽孢桿菌（Bacillm amyloliquefaciens），將其編號(hào)為B15，并對(duì)其抑菌活性成分和代謝機(jī)制進(jìn)行研究。解淀粉芽孢桿菌為學(xué)界公認(rèn)的植物病原真菌的生防細(xì)菌，能夠產(chǎn)生脂肽類抑菌物質(zhì)，并且分裂繁殖速度快、對(duì)營養(yǎng)條件要求簡單，因而被廣泛應(yīng)用于植物疫病防治和果蔬保鮮中，是經(jīng)美國食品和藥物管理局（FDA）安全認(rèn)證的菌種，也是國內(nèi)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)的生物農(nóng)藥使用菌種之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，以芽孢桿菌為基礎(chǔ)的產(chǎn)品約占細(xì)菌生物防治劑產(chǎn)品的一半[7]。

目前，國內(nèi)研究者分離、研究并進(jìn)行初步應(yīng)用的解淀粉芽孢桿菌菌株有YN-1（來源于鄭州果園）[8]、TB-2（來源于茄科作物內(nèi)生菌）、PEBA20（來源于楊樹內(nèi)生菌）、HN-06（來源于土壤）等，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌能夠抑制蘋果炭疽病、蘋果輪紋病、蘋果腐爛病、芹菜菌核病、香蕉軸腐病、桃褐腐病、煙草黑脛病、辣椒疫霉、番茄灰霉等病原菌的生長，并且應(yīng)用芽孢桿菌處理在防病穩(wěn)定性與化學(xué)農(nóng)藥的相容性等方面具有明顯優(yōu)勢[15]。

本研究分析來源于釀酒葡萄表面的解淀粉芽孢桿菌B15的抗菌譜和安全性，旨在為將該菌株作為生防菌開發(fā)生物農(nóng)藥提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻品種為明恢86、武育粳3號(hào)、沈農(nóng)265。

生防菌菌株解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）B15來源于釀酒葡萄表皮，貯藏于國家級(jí)酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心。23種植物病原見表1，來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥化學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

種子液活化培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯（NB），病原菌活化培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為改良Landy培養(yǎng)基，配方如下：30 g/L 葡萄糖，14 g/L谷氨酸鈉，0.5 g/L MgSO4，05 g/L KCl，1.0 g/L KH2PO4，0.15 mg/L FeSO4，50 mg/L MnSO4，0.16 mg/L CuSO4，pH值為7.0。

1.3 菌株B15發(fā)酵液的制備

將保存于4 ℃的解淀粉芽孢桿菌B15接種到斜面上，于30 ℃培養(yǎng)48 h，再將其接種于NB培養(yǎng)基上， 于37 ℃、 120 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h后進(jìn)行活化擴(kuò)培，得到種子液。將種子液按4%的接種量接種于改良Landy培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件振蕩培養(yǎng)50 h，得到發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液于 8 000 r/min 離心15 min，取上清液。

1.4 抗菌譜的室內(nèi)生測方法

1.4.1 植物病原菌的活化 用打孔器在實(shí)驗(yàn)室保存的23種植物病原菌平板上取1塊菌板，置于PDA平板中央，放入培養(yǎng)箱中于25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，待病原菌即將鋪滿平板時(shí)取出，用封口膜封好后放入4 ℃冰箱中備用。

1.4.2 發(fā)酵液的稀釋 經(jīng)測定，“1.3”節(jié)制備的發(fā)酵液的孢子數(shù)為1.9×108個(gè)/mL，按梯度稀釋為7個(gè)濃度（分別為150.0、50.0、25.0、10.0、5.0、1.0、0.5個(gè)/mL）的稀釋液試驗(yàn)組，分別取100 μL稀釋液加入60 mL PDA培養(yǎng)基中，平均倒3個(gè)平板，以無菌水作為對(duì)照組（即不添加解淀粉芽孢桿菌B15菌液的PDA平板），備用。

1.4.3 菌絲生長速率的測定 參照NY/T 1156.2—2006《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則 殺菌劑 第2部分：抑制病原真菌菌絲生長試驗(yàn) 平皿法》，將培養(yǎng)好的病原菌在無菌操作條件下用直徑為 7 mm 的滅菌打孔器自菌落邊緣切取菌苔（約 6 mm），將菌絲面向下接種在上述平板中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待空白對(duì)照平板中的菌落充分生長后，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計(jì)算抑制率，計(jì)算公式如下：

菌落增長直徑=菌落直徑平均值-菌餅直徑;（1）

菌絲生長抑制率=對(duì)照菌落增長直徑-處理菌落增長直徑對(duì)照菌落增長直徑×100%。（2）

采用回歸分析法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以各處理濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、以菌絲生長抑制率換算成的概率值為縱坐標(biāo)，求出回歸方程和有效抑制濃度（EC50、EC90）。

1.5 安全性測試方法

測試試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室內(nèi)進(jìn)行，澆透水后均勻撒播種子，溫室白天溫度為28 ℃，夜間溫度為25 ℃，培育1周后進(jìn)行施藥。

測定“1.3”節(jié)制備的發(fā)酵液孢子數(shù)，按梯度稀釋為3個(gè)濃度（150、50、10個(gè)/mL）的稀釋液試驗(yàn)組，以無菌水作為空白對(duì)照組，每個(gè)設(shè)濃度3個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)10株。采用Spraying System公司生產(chǎn)的氣力噴頭Air Atom噴霧，噴霧壓力0.2 MPa。

施藥后7 d通過目測法觀察各處理水稻的生長情況，觀察水稻是否有變色、壞死、萎蔫等藥害癥狀，從而判斷不同濃度解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)水稻苗的藥害情況。

藥害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（分5級(jí)）：-表示無癥狀;+表示新葉上有少量藥斑;++表示新葉上有較多藥斑，但生長基本正常;+++表示新葉畸形扭曲且少量脫落，或花蕾少量脫落，或幼果上有明顯藥斑;++++表示花蕾大量脫落，甚至新梢枯死，或花蕾大量脫落，或果實(shí)嚴(yán)重受害致畸、脫落。

測量各處理水稻的株高、根長和鮮質(zhì)量，計(jì)算不同濃度菌株B15發(fā)酵液噴霧對(duì)水稻生長的影響。試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用Duncans法比較不同處理之間水稻株高、根長和鮮質(zhì)量之間的差異顯著性。相關(guān)公式如下：

株高（鮮質(zhì)量、根長）抑制率=（CK水稻的株高、鮮質(zhì)量、根長-處理組的株高、鮮質(zhì)量、根長）/CK水稻的株高、鮮質(zhì)量、根長×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 B15發(fā)酵液抗菌譜的測定

部分室內(nèi)生物活性測定試驗(yàn)結(jié)果見圖1，其中第1個(gè)平板中的CK為空白對(duì)照，不添加解淀粉芽孢桿菌B15發(fā)酵液，其余各平板為不同稀釋濃度的解淀粉芽孢桿菌B15菌液。試驗(yàn)結(jié)果表明，病原菌在CK平板中的長勢良好，而在添加B15菌液平板中的生長受到明顯抑制，生長直徑與菌液濃度成反比。

以棉花枯萎病病菌為例，生長5 d時(shí)，測定不同濃度發(fā)酵液處理組的菌落增長直徑，從而計(jì)算抑制率（表2），按照“濃度-對(duì)數(shù)值”和“抑制率-概率值”進(jìn)行直線回歸分析（圖2），計(jì)算得出，EC50為 0.086個(gè)/mL，95%置信限為0.056～0.133個(gè)/mL，EC90為24.29個(gè)/mL，95%置信限為19.54～30.20個(gè)/mL。

采用“1.4”節(jié)的室內(nèi)生測方法測定解淀粉芽孢桿菌B15發(fā)酵液的抗菌譜，結(jié)果（表3）表明，該菌株 10 CFU/mL 稀釋發(fā)酵液對(duì)供試23種植物病原真菌的抑制率達(dá)到50%以上，其中對(duì)香菇爛筒病、蘋果腐爛病、棉花炭疽病、花生褐斑病和黃瓜枯萎病5種病原真菌的抑制率在90%以上。由此可見，解淀粉芽孢桿菌B15發(fā)酵液的抑菌范圍較廣。

2.2 安全性試驗(yàn)

噴霧處理后7 d通過目測法觀察藥害情況。由表4可以看出，3種水稻均生長正常，葉色鮮綠，無壞死斑，葉緣無枯黃狀，且無藥害產(chǎn)生。

測定每個(gè)水稻品種、每個(gè)處理（10株水稻）的株高、根長和鮮質(zhì)量。由表5可以看出，各濃度解淀粉芽孢桿菌B15對(duì)明恢86株高的影響無論在0.05水平還是在0.01水平都沒有顯著差異，而對(duì)武育粳3號(hào)品種水稻的影響有顯著差異。

由表6可以看出，各濃度的解淀粉芽孢桿菌B15對(duì)明恢86、武育粳3號(hào)2個(gè)水稻品種的根長無論在0.05水平還是在0.01水平都沒有顯著影響。在對(duì)沈農(nóng)265根長的影響方面，各濃度與CK間在0.01水平上有顯著差異，而各濃度之間不具有顯著差異。

由表7可以看出，各濃度解淀粉芽孢桿菌B15對(duì)武育粳3號(hào)2個(gè)水稻品種鮮質(zhì)量的影響無論在005水平還是在0.01水平都沒有顯著影響。而在對(duì)沈農(nóng)265的水稻鮮質(zhì)量方面，50、150 CFU/mL處理與CK在0.05水平上具有顯著差異;在001水平上，各解淀粉芽孢桿菌B15濃度與CK及其他各濃度之間都沒有顯著差異。

3 討論與結(jié)論

本研究以解淀粉芽孢桿菌B15為研究對(duì)象，進(jìn)行室內(nèi)生物活性測定和安全性測定， 旨在為將該生防菌株作為生物農(nóng)藥推廣應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌B15對(duì)23種供試植物病原菌均有抑制作用，且抑制率高，作用濃度低，同時(shí)對(duì)測試水稻植株無藥害作用，安全性高。以本研究為基礎(chǔ)，可以進(jìn)行解淀粉芽孢桿菌B15可濕性粉劑的開發(fā)與田間應(yīng)用研究。

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