雞糞生物炭對蔬菜土壤中沙門氏菌遷移和滯留存活的影響

施玉玉 張煜林 胡素萍 張?zhí)蚁?/p>

摘要：為評估生物炭施用是否影響土壤中沙門氏菌的滯留和存活行為，將在300、500、700 ℃制備的雞糞生物炭分別施用于2種典型的農(nóng)業(yè)蔬菜土壤（山東棕壤和江西紅壤）中，通過室內(nèi)一維土柱模擬試驗研究了沙門氏菌在施用生物炭土壤剖面中的縱向滯留和存活特點。結(jié)果顯示，300 ℃生物炭沒有顯著影響棕壤和紅壤中沙門氏菌的滯留，但500 ℃和700 ℃生物炭促進(jìn)了沙門氏菌在紅壤和棕壤土柱中的滯留，且700 ℃生物炭的促進(jìn)作用最為顯著（P<005）。沙門氏菌在土柱表層（0～1 cm）的滯留量高，隨著土壤剖面的加深，滯留的沙門氏菌逐漸減少。通過Weibull單指數(shù)模型擬合得出：雞糞生物炭顯著促進(jìn)了沙門氏菌在紅壤和棕壤土柱中的存活，其中300 ℃生物炭土柱中沙門氏菌的存活能力最強(qiáng)，但是生物炭制備溫度對沙門氏菌存活之間的差異并不顯著。相關(guān)性分析表明，土壤中沙門氏菌的滯留量與土壤性質(zhì)沒有顯著相關(guān)性，但沙門氏菌疏水性的變化可能是造成沙門氏菌滯留變化的部分原因。研究表明，雞糞生物炭影響了沙門氏菌在蔬菜土壤中的滯留和存活，在一定程度上增加了農(nóng)作物和飲用水被沙門氏菌污染的風(fēng)險。

關(guān)鍵詞：雞糞;生物炭;蔬菜土壤;沙門氏菌;遷移;滯留;存活

中圖分類號：S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）05-0232-06

畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的大量畜禽糞便帶來的環(huán)境問題日益凸顯，我國經(jīng)有效處理的畜禽糞便比例仍然很低，有機(jī)肥施用量僅占肥料施用總量的25%，其中工廠生產(chǎn)的僅占1%～2%，大部分畜禽糞便未經(jīng)無害化處理隨意排放到自然環(huán)境中，使得土壤、水體以及大氣等自然環(huán)境受到了嚴(yán)重的污染。畜舍糞便含有最常見的人畜共患病原菌，如沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌O157 ∶H7等，一旦進(jìn)入自然環(huán)境，將極易造成人畜傳染病的暴發(fā)，對人類健康及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成極大的威脅[3]。近年來，病原菌引起的水源性疾病的暴發(fā)越來越多地被報道，病原菌經(jīng)土體遷移后進(jìn)入地下水是大部分水源性疾病暴發(fā)的主要原因。在美國每年因地下水沙門氏菌污染引發(fā)的相關(guān)疾病高達(dá)75萬～500萬例[4]。

沙門氏菌（Salmonella）屬于革蘭氏陰性桿菌，是世界上報道最多的引起食源性疫情暴發(fā)的首要食源性病原體。大量研究表明，通過有機(jī)肥施用、廢水廢渣隨意排放等方式進(jìn)入土壤的沙門氏菌可以較高活性長期地滯留在土壤中，并隨降水遷移而污染地表及地下飲用水源，是造成水體長期污染的二次污染源，這不僅給水生生態(tài)系統(tǒng)帶來危害，還可以通過食物鏈的傳遞，對人類健康構(gòu)成巨大威脅。沙門氏菌在土壤中的向下運移受到土壤物理化學(xué)性質(zhì)的影響，如土壤質(zhì)地、結(jié)構(gòu)和含水飽和度，溶液離子強(qiáng)度和組成，土壤和溶液pH值，以及溶液和沉積物中有機(jī)碳的濃度。因此任何改變這些特性的管理措施都可能會顯著影響土壤中沙門氏菌的遷移和滯留存活。但已有研究還很少關(guān)注這些土壤管理措施對土壤中存在的病原菌環(huán)境行為的影響。

生物炭（biochar，B）屬于一種穩(wěn)定形式的碳，是由糞便、落葉、草、秸稈、木材等農(nóng)林廢棄物在低氧的條件下高溫?zé)峤馓炕傻母惶籍a(chǎn)物。生物炭作為一種多孔材料，具有比表面積大、孔隙豐富和吸附能力極強(qiáng)等特點[18]。生物炭不僅是一種良好的土壤改良劑，廣泛運用于農(nóng)業(yè)土壤修復(fù)中，改善土壤肥力、提高作物品質(zhì)和產(chǎn)量，還可以吸附土壤中的重金屬和有機(jī)污染物。我國農(nóng)田廢棄物主要以秸稈及動物糞便為主，年產(chǎn)量巨大，具有豐富的生物炭原材料，將這些廢棄物加以利用為農(nóng)田廢棄物的資源化提供了一條有利途徑[22]。目前，有關(guān)生物炭對土壤肥力增強(qiáng)、提高農(nóng)作物產(chǎn)量、改善土壤微生物環(huán)境、修復(fù)污染土壤等方面已經(jīng)取得大量的理論和應(yīng)用成果。但施用生物炭對蔬菜土壤中病原菌的存活及遷移的影響研究鮮有報道。

基于以上問題，本試驗選擇雞糞作為原料，在不同溫度下（300、500、700 ℃）熱解制備生物炭，以中國2種典型的蔬菜土壤江西紅壤（red soil，R）和山東棕壤（brown soil，B）為研究對象，研究沙門氏菌在施用了不同溫度生物炭的10 cm土柱中的遷移和滯留存活特性及其影響因素，分析比較不同溫度生物炭對土壤中沙門氏菌遷移和滯留存活行為的促進(jìn)或減弱效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試生物炭

本試驗以采集自福建福州閩侯養(yǎng)殖場的雞糞為原料，將新鮮雞糞風(fēng)干、去除大顆粒雜質(zhì)、研磨粉碎過2 mm篩，將原料在300、500、700 ℃厭氧炭化 2 h，冷卻至室溫后取出[23]。供試生物炭的各項理化性質(zhì)見表1。

1.2 供試土壤

本試驗供試土壤為取自山東省壽光市的棕壤（B）和江西省會昌縣的紅壤（R），2種土壤均是種植多年蔬菜的大棚農(nóng)業(yè)土壤，每種土壤采用“S”形多點采集土層0～20 cm范圍內(nèi)的3個重復(fù)混合土樣。采集到的新鮮土樣先除去留存的植株枝葉和碎石塊等雜質(zhì)，研磨過2 mm土篩，過篩后的新鮮土壤一部分自然風(fēng)干后測定其物理化學(xué)性質(zhì)，另一部分土壤添加一定比例的雞糞生物炭，平衡1周后進(jìn)行沙門氏菌室內(nèi)土柱遷移模擬試驗，同時測定施用雞糞生物炭后土壤的理化性質(zhì)。供試土壤的各項理化性質(zhì)，由表2可見。

1.3 供試菌種

采用革蘭氏陰性沙門氏菌作為本試驗供試菌種，其最適繁殖溫度為37 ℃。將冷凍保存的沙門氏菌于恒溫振蕩器37 ℃培養(yǎng)活化后，置于加有含 100 μg/mL 利福平（沙門氏菌抗利福平馴化濃度為120 μg/mL）的腦心萃取液培養(yǎng)基中，在恒溫水浴振蕩器（37.0 ℃、150 r/min）中振蕩培養(yǎng)12 h至對數(shù)生長期初期，添加適量無菌磷酸緩沖液（PBS）離心淋洗多次（4 ℃、10 min、4 000 r/min）洗凈沙門氏菌表面的培養(yǎng)基，最后加入適量無菌水稀釋菌液，采用紫外分光光度計最終調(diào)節(jié)菌液吸光度（D值）約為0.5，此時菌液的濃度為1.0×108 CFU/mL。

1.4 土柱中沙門氏菌的遷移和滯留存活

本試驗于2018年9—12月于福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院實驗室進(jìn)行，運用一維土柱模擬沙門氏菌在土壤中的遷移行為，入滲試驗裝置主要包括土柱柱身、供水設(shè)備和收集設(shè)備。土柱采用的是有機(jī)玻璃材質(zhì)制成的頂部開口的柱狀容器，高10 cm，直徑 5 cm，柱身光滑可從中間一分為二打開，底部中心有一小孔起到引流的作用;供水設(shè)備使用的是醫(yī)用無菌吊瓶，容量為200 mL，利用吊瓶的可調(diào)節(jié)液體流通速率的特點，使菌液均勻滲入土壤中;收集裝置使用的是布氏漏斗和玻璃瓶，采集下滲液。通過以下2個系列試驗，研究沙門氏菌在添加雞糞生物炭土壤剖面中的遷移和滯留存活情況。

試驗一：稱取一定量土樣加入3%生物炭攪拌均勻，室溫平衡培養(yǎng)1周后將土樣均分裝入土柱中，裝填的土柱高10 cm、直徑5 cm，同時進(jìn)行3個不添加生物炭的空白處理。通過供水裝置將無菌水以 2 mL/s 慢速入滲到土柱中，直至土壤呈飽和狀態(tài)。隨后將培養(yǎng)好的沙門氏菌菌液勻速地流入土柱中，完成入滲試驗后，立即以同樣速度通入同樣體積的無菌1 mmol/L KCl，收集流出的滲濾液，逐級稀釋至適當(dāng)濃度，大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行涂平板計數(shù)，計算滲濾液中沙門氏菌的濃度。

試驗二：土柱遷移試驗完成后，分別于0、10、20、30和50 d分層取樣（0～1、1～3、3～6、6～9 cm），采集土柱各層樣品，測定其沙門氏菌菌落個數(shù)：稱0.5 g土樣于離心管中，加入5 mL 0.1%蛋白胨緩沖液充分渦旋混勻，吸取100 μL懸浮液于裝有900 μL無菌水的離心管中，逐級稀釋一定倍數(shù)后，吸取100 μL菌液涂抹至大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（添加100 μg/mL利福平），于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)過夜、計數(shù)。將不同時間點的土壤中沙門氏菌的存活濃度轉(zhuǎn)化為lg（CFU/g），通過Weibull單指數(shù)模型[13]模擬，計算得出滯留在土柱中沙門氏菌達(dá)到最低檢測線的存活時間（t，d）。

2 結(jié)果與分析

2.1 土柱中沙門氏菌的總滯留量及平均滯留菌數(shù)

由表3可知，空白土壤中，沙門氏菌在紅壤中的遷移能力強(qiáng)于棕壤，棕壤中滯留的沙門氏菌是紅壤中滯留量的近3倍。添加雞糞生物炭后，棕壤和紅壤中沙門氏菌的滯留量較大，平均滯留菌數(shù)為 4.14×107～1.78×108 CFU/g，且紅壤和棕壤中沙門氏菌總滯留量高于空白土壤。與棕壤相比，雞糞生物炭對紅壤中滯留沙門氏菌的增加影響更為顯著（P<0.05）。隨著生物炭制備溫度的升高，土壤中沙門氏菌的滯留量逐步增加，說明生物炭減弱了沙門氏菌在紅壤和棕壤土柱中的遷移行為。添加300 ℃生物炭均沒有顯著影響沙門氏菌在棕壤中的滯留，甚至還促進(jìn)了沙門氏菌在紅壤土柱中的遷移。然而500 ℃和700 ℃生物炭顯著增加了沙門氏菌在紅壤和棕壤中的滯留，其中，700 ℃生物炭促進(jìn)作用最為顯著（P<0.05）。

2.2 土柱中沙門氏菌的縱向剖面分布

對土柱不同剖面深度進(jìn)行分層取樣，計算沙門氏菌在土柱各層中的存活個數(shù)且轉(zhuǎn)化為lg（CFU/g），得出沙門氏菌在土柱中的縱向剖面分布。由圖1可知，添加雞糞生物炭后，沙門氏菌在表層（0～1 cm）滯留量高，沙門氏菌的濃度范圍為4.7×107～3.0×108 CFU/g，均大于1～3、3～6、6～9 cm土層，隨著沙門氏菌逐漸運移到1～3 cm土層，各土壤中的沙門氏菌存活數(shù)量略有降低，而在土層6～9 cm 處，土柱各層中沙門氏菌的濃度下降迅速，有 1～2 個數(shù)量級的減少。

雞糞生物炭增加了棕壤和紅壤各剖面深度中沙門氏菌的滯留量，300 ℃生物炭對棕壤和紅壤土柱各剖面深度中沙門氏菌的遷移均無顯著影響，隨著生物炭制備溫度的升高，雞糞生物炭對沙門氏菌遷移滯留的影響越顯著，生物炭制備溫度對沙門氏菌滯留的影響順序為700 ℃>500 ℃>300 ℃。

2.3 土柱中滯留沙門氏菌的存活動態(tài)

Weibull單指數(shù)模型擬合得出沙門氏菌在紅壤和棕壤中的存活方程決定系數(shù)（R2）范圍為0.94～99.00，說明該模型很好地擬合了各層土柱中沙門氏菌的存活動態(tài)，δ（尺度參數(shù)）的范圍為5.43～1002，p（弧度參數(shù)）的范圍為0.69～1.58。根據(jù)各參數(shù)計算和沙門氏菌在土柱各層土壤中的存活時間（達(dá)到最低檢測線所需時間t）發(fā)現(xiàn)，雞糞生物炭顯著促進(jìn)了沙門氏菌在紅壤土柱中的存活，添加生物炭后土柱中沙門氏菌的存活時間范圍為 39.45～34.03 d，其中，300 ℃生物炭土柱中沙門氏菌的存活能力最強(qiáng)，但生物炭制備溫度對沙門氏菌存活的影響并不顯著。滯留在棕壤土柱中沙門氏菌存活時間均顯著長于紅壤土柱（83.67～53.60 d），滯留在棕壤土柱中沙門氏菌存活時間順序為300 ℃>500 ℃>700 ℃，300 ℃雞糞生物炭對棕壤中沙門氏菌的存活的促進(jìn)作用最強(qiáng)，存活時間長達(dá)83.67 d。然而與空白土壤相比，500 ℃和700 ℃生物炭對滯留在土柱中的沙門氏菌無顯著影響。雖然添加雞糞生物炭紅壤和棕壤土柱中滯留的沙門氏菌隨著剖面深度的增加逐漸減少（圖3），但各土層中（0～3 cm、3～6 cm、6～9 cm）沙門氏菌存活時間并無顯著區(qū)別（圖4）。

2.4 土壤和沙門氏菌性質(zhì)對土柱中沙門氏菌滯留的影響

本研究通過SPSS 21.0軟件對雞糞生物炭添加前后沙門氏菌的滯留量與土壤各項理化性質(zhì)間的相關(guān)性進(jìn)行了綜合探討。結(jié)果表明，土壤中沙門氏菌的滯留量與土壤性質(zhì)均沒有呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，說明添加生物炭后土壤性質(zhì)的改變不是影響土柱中沙門氏菌滯留的主要原因。為研究生物炭添加對沙門氏菌滯留的影響是否與沙門氏菌細(xì)胞特性的變化有關(guān)，測量了不同生物炭添加的紅壤和棕壤土柱收集的滲濾液中沙門氏菌的Zeta電位和疏水性。由表4可知，沙門氏菌的Zeta電位差異很小，這些微小差異并不能解釋添加生物炭對柱中細(xì)菌滯留程度的影響。相比之下，生物炭處理的紅壤和棕壤土柱收集的浸出液中沙門氏菌的疏水性值顯著升高，沙門氏菌疏水性值的變化趨勢與土柱中細(xì)菌的滯留量一致，說明土壤生物炭添加后沙門氏菌疏水性的變化可能是造成沙門氏菌滯留變化的部分原因。

3 討論

本次研究采集山東棕壤和江西紅壤2種我國主要的蔬菜土壤研究雞糞生物炭對土壤中沙門氏菌遷移和滯留存活的影響。棕壤和紅壤形成的氣候條件、水熱條件、成土母質(zhì)、施肥和耕種方式等不同，使2種蔬菜土壤的pH值和養(yǎng)分含量等差異巨大;生物炭可通過自身的特殊結(jié)構(gòu)和對土壤性質(zhì)影響，改善土壤強(qiáng)酸性、營養(yǎng)元素有效性低以及重金屬和有機(jī)污染等問題[21]。土壤類型可能會改變生物炭對土壤的化學(xué)和物理性質(zhì)的影響，這些性質(zhì)已知會影響細(xì)菌的滯留[23]。如生物炭對土壤和溶液pH值的影響可能因土壤質(zhì)地而異，因為土壤緩沖能力隨黏土含量而異[24]。本試驗中施用300、500、700 ℃ 制備的雞糞生物炭不同程度地改變了棕壤和紅壤的相關(guān)性狀，主要表現(xiàn)在，施用300、500、700 ℃ 雞糞生物炭后紅壤pH值顯著增加，土壤pH值由5.29分別上升至6.80、7.05和7.04，同時生物炭也顯著提高紅壤的有機(jī)質(zhì)、總氮和全磷含量，但是生物炭并沒有顯著改變棕壤的pH值。

生物炭可以通過對土壤理化性質(zhì)的影響，改變土壤對沙門氏菌的吸附能力，進(jìn)而影響沙門氏菌在土壤中的遷移和滯留存活行為。同時，生物炭本身的多孔性結(jié)構(gòu)和生物炭表面豐富的各類有機(jī)化合物通過對沙門氏菌的吸附作用調(diào)控沙門氏菌在土壤中的遷移和滯留存活。土柱模擬試驗結(jié)果顯示，在水飽和條件下，不添加生物炭的紅壤中沙門氏菌的滯留量少于棕壤，棕壤和紅壤中接種的沙門氏菌由于施用不同溫度（300、500、700 ℃）的雞糞生物炭而顯示出不同的遷移行為。300 ℃生物炭均沒有顯著影響棕壤中沙門氏菌滯留，甚至還促進(jìn)了沙門氏菌在紅壤中的遷移。研究表明，有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量高的土壤對病原菌的吸附能力低于有機(jī)質(zhì)含量低的土壤。Ams等研究發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)主要包裹在鐵鋁氧化物表面，因此土壤有機(jī)質(zhì)含量低的土壤表面更多的鐵鋁氧化物暴露在外，從而顯著促進(jìn)對微生物的吸附[26]。因此，空白土壤及300 ℃生物炭的添加引起土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量的升高可能是導(dǎo)致滯留在土柱中沙門氏菌減少的原因之一。

500、700 ℃生物炭促進(jìn)了沙門氏菌在棕壤和紅壤中的滯留。添加生物炭后細(xì)菌附著增加，可能是由于比表面積增加導(dǎo)致沙門氏菌滯留著位點增加[27]。Abit等對生物炭的掃描電子顯微鏡圖像顯示，除了膠體可附著的外表面外，生物炭還有可能導(dǎo)致更多附著位點和更有效的膠體包裹內(nèi)表面，且較高的熱解溫度會產(chǎn)生含有更多細(xì)小顆粒的生物炭和更高的微孔率，兩者都會導(dǎo)致更高的比表面積，促進(jìn)了沙門氏菌在紅壤和棕壤土柱中的滯留[27]。本次研究中雞糞生物炭的添加提高了紅壤和棕壤的pH值，但大量研究表明，pH值升高會讓沙門氏菌表面帶更多的負(fù)電荷，增強(qiáng)土壤顆粒及大腸桿菌之間的靜電斥力，減弱土壤顆粒對沙門氏菌的吸附，本研究結(jié)果與之相反，說明高溫生物炭的本身多空隙結(jié)構(gòu)及沙門氏菌表面形狀的改變可能是導(dǎo)致紅壤和棕壤土柱中沙門氏菌滯留增多的主要原因。

本試驗發(fā)現(xiàn)，滯留在土柱中的沙門氏菌可存活25.69～83.67 d，生物炭顯著促進(jìn)了滯留在紅壤和棕壤土柱中沙門氏菌的存活，且300 ℃生物炭對沙門氏菌的存活促進(jìn)作用強(qiáng)于500 ℃和700 ℃生物炭，說明低溫生物炭特殊的結(jié)構(gòu)組成及對土壤性質(zhì)的影響有利于滯留在土壤中沙門氏菌的存活。相關(guān)性分析結(jié)果表明，土壤理化性質(zhì)與滯留在土壤中沙門氏菌量無顯著關(guān)系，但是沙門氏菌表面疏水性的變化卻可能是生物炭添加引起沙門氏菌滯留量增加的部分原因，這些結(jié)果與Abit涉及大腸桿菌和沙門氏菌土柱遷移的發(fā)現(xiàn)相一致，表明細(xì)菌表面較高的疏水性增強(qiáng)向礦物顆粒表面的黏附[24]。后續(xù)需要進(jìn)一步研究來闡明細(xì)菌疏水性的變化與經(jīng)生物炭改良的土壤中病原菌滯留量間的關(guān)系。

綜上，生物炭施加的蔬菜土壤可滯留大部分的沙門氏菌，且滯留的沙門氏菌最長存活時間可達(dá) 83 d，說明生物炭影響了沙門氏菌由土壤向農(nóng)作物和水體的遷移，在一定程度上增加了農(nóng)作物和飲用水被沙門氏菌污染的風(fēng)險。因此在實際操作中，需正確把握土壤類型以及生物炭的制備溫度，以此平衡生物炭對土壤的改良效果和其帶來的生態(tài)風(fēng)險。

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