蘇北地區(qū)奶牛場(chǎng)無(wú)乳鏈球菌分離株毒力分析

馬芳 周明旭 張金秋 楊世芳 盧宇 鄧碧華

摘要：奶牛乳腺炎導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降和乳制品質(zhì)量降低，是奶牛養(yǎng)殖業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)性疾病，在全球范圍內(nèi)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。選取蘇北奶牛場(chǎng)3株代表性無(wú)乳鏈球菌分離株，SAG-FX17分離自臨床型乳腺炎、CM31分離自隱性乳腺炎和CM41b分離自隱性發(fā)展為臨床型乳腺炎奶牛乳汁，研究比較3株細(xì)菌生長(zhǎng)特性、毒力因子分布、形成生物被膜能力及其對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的黏附、侵襲和胞內(nèi)存活能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，3株分離株血清型均為Ⅰa型，2b型菌毛，gapC基因和cylE基因陽(yáng)性，但僅SAG-FX17的α相關(guān)蛋白家族為Alp1型，其他2株為未定型。研究發(fā)現(xiàn) SAG-FX17 與奶牛乳腺上皮細(xì)胞（Mac-T）共孵育時(shí)生成生物被膜能力明顯增強(qiáng)，且該菌對(duì)Mac-T細(xì)胞黏附率為525%，顯著高于CM31和CM41b。侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明，3株細(xì)菌侵襲到細(xì)菌內(nèi)部的能力很低，但侵襲到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌具有一定存活能力，侵入細(xì)胞4 h 3株分離株SAG-FX17、CM31、CM41b存活率分別為24%、18%、86.7%。綜上所述，無(wú)乳鏈球菌在奶牛乳腺上皮細(xì)胞表面形成生物被膜及其在胞內(nèi)存活能力是影響細(xì)菌致病性的重要因素。

關(guān)鍵詞：無(wú)乳鏈球菌;毒力因子：生物被膜;黏附;胞內(nèi)存活能力;奶牛場(chǎng);蘇北地區(qū)

中圖分類(lèi)號(hào)： S852.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）05-0142-08

奶牛乳腺炎是奶牛最常發(fā)病、治療費(fèi)用最高的疾病，全世界約有1/3奶?；加腥橄傺?，導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。奶牛乳腺炎根據(jù)癥狀分為臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎。臨床型乳腺炎發(fā)病急、癥狀明顯;隱性乳腺炎一般難以直接觀(guān)察到臨床感染癥狀，不能及時(shí)隔離、治療，容易被忽視，但其具備轉(zhuǎn)化為臨床型乳腺炎的風(fēng)險(xiǎn)，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重影響[3]。

奶牛乳腺炎的致病因素包括病原體、宿主和環(huán)境因素，其中細(xì)菌乳腺內(nèi)感染為最主要因素[4]。宿主與病原微生物互相作用結(jié)果的不同，細(xì)菌感染引起乳腺炎臨床表現(xiàn)不同，如金黃色葡萄球菌黏附侵襲到宿主細(xì)胞內(nèi)部并逃避宿主先天性免疫反應(yīng)，易導(dǎo)致隱性乳腺炎;大腸桿菌感染后大量增殖釋放毒素引起宿主細(xì)胞因子釋放，易導(dǎo)致臨床型乳腺炎[5]。葡萄球菌和鏈球菌是導(dǎo)致奶牛乳腺炎最常見(jiàn)的和造成經(jīng)濟(jì)損失最大的致病菌，無(wú)乳鏈球菌雖然只在乳腺組織內(nèi)生長(zhǎng)和增殖，但該菌可以在乳腺組織外短時(shí)間存活，同時(shí)通常會(huì)導(dǎo)致隱性乳腺炎，因此牛場(chǎng)一旦感染，極易導(dǎo)致該菌傳播擴(kuò)散[6]。1887年無(wú)乳鏈球菌作為奶牛乳腺炎致病菌首次被鑒定，后來(lái)發(fā)現(xiàn)該菌還可以造成人類(lèi)尤其懷孕女性、早產(chǎn)兒和新生兒感染[7]。無(wú)乳鏈球菌又稱(chēng)為B族鏈球菌，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，根據(jù)莢膜多糖抗原性與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為10個(gè)血清型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ），其中85%～90%的臨床分離株為Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ和Ⅴ型[8]。

無(wú)乳鏈球菌感染機(jī)制主要包括以下3種機(jī)制：（1）定植和穿越組織屏障;（2）逃避宿主防御機(jī)制;（3）表達(dá)毒力因子[7]。細(xì)菌黏附乳腺上皮細(xì)胞并侵入到細(xì)胞內(nèi)部是細(xì)菌引起乳腺炎的重要機(jī)制。無(wú)乳鏈球菌經(jīng)乳頭感染定殖于乳腺細(xì)胞和乳導(dǎo)管并大量繁殖，導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞損傷。大量中性粒細(xì)胞涌入阻塞乳導(dǎo)管，影響泌乳和細(xì)菌排出，進(jìn)而引起腺泡退化喪失泌乳機(jī)能。無(wú)乳鏈球菌編碼大量毒力因子對(duì)該菌的致病力起到關(guān)鍵作用，如產(chǎn)生 β-溶血素裂解細(xì)胞[8]。同時(shí)，毒力因子也在無(wú)乳鏈球菌黏附、入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中存在關(guān)鍵作用，因此對(duì)臨床分離細(xì)菌進(jìn)行毒力因子檢測(cè)有利于更好地評(píng)價(jià)細(xì)菌致病性，也為進(jìn)一步研究細(xì)菌感染宿主的機(jī)制提供理論依據(jù)。

前期研究在蘇北地區(qū)多個(gè)奶牛場(chǎng)進(jìn)行采樣，獲得無(wú)乳鏈球菌6株，本試驗(yàn)對(duì)其中3株典型無(wú)乳鏈球菌（SAG-FX17分離自臨床乳腺炎奶牛乳汁，CM31和CM41b分離自隱性乳腺炎奶牛乳汁，其中CM41b分離株宿主由陰性隱性感染轉(zhuǎn)臨床癥狀）進(jìn)行研究比較，包括細(xì)菌毒力因子分布、生長(zhǎng)特性及與細(xì)胞的互作特征等，為進(jìn)一步研究無(wú)乳鏈球菌致奶牛乳腺炎的毒力機(jī)制提供理論支持，也為通過(guò)研制疫苗等方式預(yù)防奶牛無(wú)乳鏈球菌乳腺炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

無(wú)乳鏈球菌SAG-FX17、CM31、CM41b分別分離自蘇北地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)并由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所疫苗制造工程研究室保存[9];奶牛乳腺上皮細(xì)胞Mac-T由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所疫苗制造工程研究室保存，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。試劑 THB培養(yǎng)基、胰蛋白酶為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品;結(jié)晶紫染色液瓊脂為南京翼飛雪生物科技有限公司產(chǎn)品;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品;DMEM為T(mén)hermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品;青霉素、鏈霉素為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品;2×TaqMaster Mix為南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

將37 ℃ 180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌以1 ∶100分別轉(zhuǎn)接到THB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，5 000 r/min離心5 min，收集菌體并用無(wú)菌PBS（8 mmol/L Na2HPO4、0.136 mol/L NaCl、2 mmol/L KH2PO4和2.6 mmol/L KCl）清洗3次，用于后續(xù)研究。

1.3 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)檢測(cè)

將過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌以1 ∶100分別轉(zhuǎn)接到 100 mL THB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取樣檢測(cè)其D600 nm，連續(xù)檢測(cè)至細(xì)菌D600 nm保持穩(wěn)定。

1.4 提基因組

取3 mL過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌通過(guò)5 000 r/min離心5 min收集于1.5 mL EP管中，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取細(xì)菌基因組DNA，最后以50 μL ddH2O溶解，提取基因組作為PCR反應(yīng)模板備用。

1.5 毒力基因檢測(cè)

本研究對(duì)分離株的相關(guān)毒力基因包括莢膜多糖合成酶相關(guān)基因、β蛋白編碼基因bac、α相關(guān)蛋白基因（bca、alp1、rib、alp2、alp3和alp4的基因）、β-溶血素結(jié)構(gòu)基因cylE、菌毛骨架蛋白編碼基因spb、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）編碼基因gapC、5a肽酶編碼基因scpB進(jìn)行鑒定，僅模板用無(wú)菌超純水為陰性對(duì)照組。本研究中所用的引物見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 乳酸脫氫酶（LDH）試驗(yàn)

將奶牛乳腺上皮細(xì)胞（Mac-T）培養(yǎng)于96孔板中長(zhǎng)至80%以上單層細(xì)胞，用無(wú)血清的DMEM清洗細(xì)胞3次，每孔加入200 μL無(wú)血清DMEM。細(xì)菌以MOI=10感染細(xì)胞，孵育3、4、5、6、24 h用LDH活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)450 nm下上清液的吸光度，陰性對(duì)照為無(wú)細(xì)菌感染的細(xì)胞組。

1.7 細(xì)菌黏附Mac-T細(xì)胞試驗(yàn)

將Mac-T細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中長(zhǎng)滿(mǎn)至少80%的單層細(xì)胞用無(wú)血清的DMEM清洗細(xì)胞3次，每孔加入無(wú)血清DMEM 500 μL。細(xì)菌以MOI=10感染細(xì)胞， 800g離心10min使細(xì)菌與細(xì)胞充分接觸，置于培養(yǎng)箱中作用1 h。對(duì)照組為等量細(xì)菌與DMEM孵育1 h。作用后，用無(wú)菌PBS清洗3次去掉沒(méi)有黏附的細(xì)菌。細(xì)胞中加入100 μL/孔無(wú)菌05% TritonX-100置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 min裂解細(xì)胞釋放細(xì)菌。黏附的細(xì)菌通過(guò)涂布THB平板進(jìn)行定量，黏附率=（試驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)量/對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量）×100%。

1.8 細(xì)菌侵襲試驗(yàn)

將Mac-T細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中長(zhǎng)滿(mǎn)至少80%的單層細(xì)胞，用無(wú)血清的DMEM清洗細(xì)胞3次，加入無(wú)血清DMEM 500 μL/孔。細(xì)菌以MOI=10感染細(xì)胞，800 g離心10 min使細(xì)菌與細(xì)胞充分接觸，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用2 h。作用后，用無(wú)菌PBS清洗3次清洗掉沒(méi)有黏附的細(xì)菌。細(xì)胞中加入1 mL/孔含有100 μg/mL慶大霉素和5 μg/mL青霉素G的DMEM并作用1 h殺死細(xì)胞外細(xì)菌。孵育后用無(wú)菌PBS清洗3次，加入100 μL/孔 0.5% TritonX-100孵育5 min裂解細(xì)胞釋放細(xì)菌，侵襲到細(xì)胞中的細(xì)菌通過(guò)涂布THB平板進(jìn)行定量。對(duì)照組為等量細(xì)菌與DMEM孵育2 h后直接涂布THB平板定量。侵襲率=（試驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)量/對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量）×100%。

1.9 細(xì)菌胞內(nèi)存活試驗(yàn)

將Mac-T細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中長(zhǎng)滿(mǎn)至少80%的單層細(xì)胞，用無(wú)血清的DMEM清洗細(xì)胞3次，每孔加入無(wú)血清DMEM 500μL。細(xì)菌以MOI=10感染細(xì)胞，800g離心10 min使細(xì)菌與細(xì)胞充分接觸，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用2 h，作用后用無(wú)菌PBS清洗3次清洗掉沒(méi)有黏附的細(xì)菌。細(xì)胞中加入1 mL/孔含有100 μg/mL慶大霉素和5 μg/mL青霉素G的DMEM，分別孵育1、2、3、4 h殺死細(xì)胞外黏附的細(xì)菌。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)孔細(xì)胞用無(wú)菌PBS清洗3次，加入100 μL/孔 0.5% TritonX-100 孵育 5 min 裂解細(xì)胞釋放胞內(nèi)活菌，涂布THB平板定量。細(xì)菌與Mac-T細(xì)胞作用2 h后，加入抗生素殺死胞外細(xì)菌，抗生素作用1 h所得細(xì)菌數(shù)定為胞內(nèi)存活細(xì)菌總數(shù)為100%，分別計(jì)算抗生素作用2、3、4 h后的細(xì)菌存活率分別記為Δ1 h、Δ2 h、Δ3 h。Δnh胞內(nèi)細(xì)菌存活率=×100%，n=1，2，3。

1.10 細(xì)菌體外生物被膜培養(yǎng)與檢測(cè)

將Mac-T細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中長(zhǎng)至80%以上單層細(xì)胞，用無(wú)血清的DMEM清洗細(xì)胞3次，加入無(wú)血清DMEM 200 μL/孔，細(xì)菌以MOI=10感染細(xì)胞。陰性對(duì)照為沒(méi)有細(xì)菌感染的細(xì)胞組，同時(shí)設(shè)置僅有細(xì)菌沒(méi)有細(xì)胞的組為空白對(duì)照。將96孔細(xì)胞板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h，孵育后將細(xì)胞板中的培養(yǎng)液棄去，用無(wú)菌PBS清洗3次，加 200 μL/孔 甲醇固定15 min，自然風(fēng)干用后加 200 μL/孔 1%結(jié)晶紫染色液染色15 min，PBS清洗3次，自然干燥后細(xì)胞板中的生物被膜用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.11 數(shù)據(jù)處理

采用GraphpadPrism 5軟件和SPSS V25.0進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)特性

3株奶牛乳汁無(wú)乳鏈球菌分離株SAG-FX17、CM31、CM41b在THB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)，試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果（圖1）顯示，3株細(xì)菌遲緩期、對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期的生長(zhǎng)曲線(xiàn)沒(méi)有明顯區(qū)別。說(shuō)明細(xì)菌生長(zhǎng)特性不是導(dǎo)致3株無(wú)乳鏈球菌毒力差異的原因。

2.2 主要毒力因子鑒定

通過(guò)多重PCR對(duì)莢膜多糖合成酶相關(guān)基因鑒定，結(jié)果（圖2-A）表明，3株無(wú)乳鏈球菌分離株SAG-FX17、CM31、CM41b均屬于Ⅰa型。對(duì)無(wú)乳鏈球菌3種菌毛骨架蛋白BP-1、BP-2a、BP-2b基因sbp1、sbp2a、sbp2b進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖2-B）表明3株菌都有2b型菌毛骨架蛋白基因spb2b。PCR檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌β溶血素編碼基因cylE發(fā)現(xiàn)3株菌均攜帶該基因（圖2-C）。PCR鑒定無(wú)乳鏈球菌β蛋白編碼基因bac，結(jié)果（圖2-D）顯示3株菌均不攜帶該基因。ScpB編碼的C5a肽酶是一種滅活人C5a的絲氨酸表面結(jié)合蛋白酶，研究認(rèn)為其可以阻止C5a與中性粒細(xì)胞結(jié)合，抑制炎癥時(shí)吞噬細(xì)胞的化學(xué)攻擊作用，結(jié)果（圖2-E）顯示3株分離株scpB基因?yàn)殛幮?。無(wú)乳鏈球菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）編碼基因gapC的PCR鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株菌均為gapC陽(yáng)性（圖2-F）。Alp家族是α相關(guān)蛋白家族的總稱(chēng)，目前鑒定發(fā)現(xiàn)包括6個(gè)成員：α、Rib、Alp2、Alp3、Epilons（Alp1）和Alp4蛋白，這些蛋白僅重復(fù)序列數(shù)目不同，其他差異很小。通過(guò)PCR結(jié)果片段大小判斷菌株Alp結(jié)果，其中結(jié)果陰性判定為未定型，研究結(jié)果（圖2-G）顯示3株牛源無(wú)乳鏈球菌分離株7為Alp1型，其他2株為未定型。

2.3 LDH細(xì)胞毒性試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的毒性，對(duì)細(xì)菌孵育細(xì)胞3、4、5、6、24 h后培養(yǎng)基中LDH進(jìn)行定量。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞后會(huì)導(dǎo)致胞漿中酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶釋放到培養(yǎng)液中，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)液中LDH的檢測(cè)從而對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行定量。從圖3可以看出，細(xì)菌感染細(xì)胞6 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性影響不大。24 h后細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的毒性明顯增強(qiáng)，但由于培養(yǎng)基中沒(méi)有加血清，所以陰性對(duì)照組細(xì)胞活性也明顯降低。研究結(jié)果表明，體外試驗(yàn)中在感染前期細(xì)菌對(duì)細(xì)胞毒性較小，可以展開(kāi)細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附、侵襲等研究。

2.4 細(xì)菌黏附Mac-T細(xì)胞能力

黏附試驗(yàn)結(jié)果表明，3株無(wú)乳鏈球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞Mac-T的黏附能力具有顯著差異（P<0.05）。從圖4可以看出，分離株SAG-FX17對(duì)Mac-T的黏附率高達(dá)52.5%;分離株CM31對(duì) Mac-T 的黏附率在18%左右;而分離株CM41b對(duì)Mac-T的黏附率很低，僅在7%左右。

2.5 細(xì)菌侵襲Mac-T細(xì)胞能力

從圖5可以看出，3株牛源無(wú)乳鏈球菌分離株對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞Mac-T的侵襲力非常低，其中分離株SAG-FX17雖然對(duì)Mac-T的黏附率超過(guò)50%，但該菌對(duì)細(xì)胞的侵襲率僅為0.001%左右。分離株CM31和CM41b對(duì)Mac-T的侵襲率僅為0.000 3%和0.000 4%。該結(jié)果說(shuō)明3株無(wú)乳鏈球菌均不易侵襲到奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)部。

2.6 細(xì)菌在Mac-T細(xì)胞中存活能力

從圖6可以看出，侵入到乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)部的無(wú)乳鏈球菌具有一定的存活能力，分離株SAG-FX17在侵入細(xì)胞內(nèi)2 h（Δ1h）約49%的細(xì)菌存活，3 h后（Δ2 h）胞內(nèi)細(xì)菌明顯地減少，僅26%的細(xì)菌存活，但4 h后（Δ3 h）仍有24%的細(xì)菌存活。僅有13%的CM31侵入細(xì)胞2 h后存活，但3、4 h后細(xì)菌的存活率沒(méi)有明顯的變化，分別為14%、18%，說(shuō)明CM31分離株侵入細(xì)胞后大部分細(xì)菌會(huì)被殺死但仍有少量細(xì)菌能保持活力。分離株CM41b侵入細(xì)胞2 h后54%的細(xì)菌存活，3、4 h后胞內(nèi)細(xì)菌反而增加，分別為88.4%、86.7%，說(shuō)明細(xì)菌可能克服胞內(nèi)殺菌活性，在細(xì)胞內(nèi)存活并增殖?？股刈饔? h所得細(xì)菌數(shù)定為胞內(nèi)存活細(xì)菌總數(shù)，為100%，分別計(jì)算抗生素作用2、3、4 h后的細(xì)菌存活率，記為 Δ1 h、Δ2 h、Δ3 h。

2.7 細(xì)菌形成生物被膜能力

3株細(xì)菌在體外培養(yǎng)基中均不產(chǎn)生生物被膜，但當(dāng)與細(xì)胞共孵育時(shí)分離株SAG-FX17形成生物被膜的能力明顯增強(qiáng)（圖7）。說(shuō)明該細(xì)菌可能通過(guò)形成生物被膜黏附在奶牛乳腺上皮細(xì)胞表面，并增強(qiáng)細(xì)胞在體內(nèi)的存活能力。

3 討論與結(jié)論

無(wú)乳鏈球菌又稱(chēng)B族鏈球菌，能夠感染人、魚(yú)、奶牛等多種宿主。奶牛乳腺炎由多種致病因素，無(wú)乳鏈球菌是導(dǎo)致奶牛乳腺炎的主要致病菌，引起臨床型或隱性乳腺炎，導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和乳制品質(zhì)量明顯下降，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。本研究選取分離自蘇北奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)且具有代表性的3株無(wú)乳鏈球菌作為研究對(duì)象，其中分離株SAG-FX17分離自臨床型乳腺炎奶牛乳汁，CM31和CM41b分離自隱性乳腺炎奶牛乳汁，其中CM41b分離株宿主由隱性轉(zhuǎn)為臨床型。因此比較3株代表性細(xì)菌的感染特性有利于進(jìn)一步研究無(wú)乳鏈球菌的致病機(jī)制。

分泌毒力因子是無(wú)乳鏈球菌致病的重要機(jī)制之一，莢膜幫助細(xì)菌抵抗宿主吞噬細(xì)胞吞噬、逃避補(bǔ)體系統(tǒng)的作用，是該菌主要的毒力因子[11]。根據(jù)莢膜多糖的結(jié)構(gòu)特征，無(wú)乳鏈球菌分為10個(gè)血清型，其中Ⅰa型和Ⅲ型為造成新生兒疾病和奶牛乳腺炎最常見(jiàn)的血清型，尤其Ⅰa型為人源和牛源感染的主要血清型[12]，本研究中3株奶牛乳汁分離株均為Ⅰa型，說(shuō)明Ⅰa型為該地區(qū)無(wú)乳鏈球菌流行株的優(yōu)勢(shì)血清型。無(wú)乳鏈球菌表面具有菌毛，分為1型和2菌毛，其中2型菌毛編碼基因包括2種不同序列的等位基因（分為2a型和2b型菌毛）。菌毛由骨架蛋白BP與輔助蛋白AP-1、AP-2共同組裝成完整結(jié)構(gòu)，參與細(xì)菌黏附、侵襲等致病過(guò)程[13]，本研究中3株菌為2b型菌毛。scpB基因編碼的C5a肽酶是無(wú)乳鏈球菌常見(jiàn)的毒力因子，研究人源和牛源無(wú)乳鏈球菌時(shí)發(fā)現(xiàn)人源分離株菌含有該基因，而僅部分牛源分離株具有該基因[14]，本研究中3株菌缺乏該基因，可能為菌株適應(yīng)宿主而缺失。gapC蛋白具有 3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）活性，是糖酵解的關(guān)鍵酶保守性高，在包括化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌等致病性鏈球菌細(xì)胞壁蛋白研究中均有報(bào)道，gapC蛋白分泌到細(xì)菌表面后與宿主細(xì)胞外間質(zhì)互作，幫助細(xì)菌黏附侵襲[15]。β溶血素不僅具有紅細(xì)胞毒性而且能溶解多種真核細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞死亡，又稱(chēng)溶細(xì)胞素，研究表明具有β溶血素的無(wú)乳鏈球菌菌株毒力明顯高于非溶血性菌株。本研究中3株細(xì)菌gapC基因和β溶血素編碼基因cylE均為陽(yáng)性。α相關(guān)蛋白家族是無(wú)乳鏈球菌重要的具有保護(hù)性表位的表面蛋白家族，目前已鑒定出6個(gè)成員，分別為α、Rib、Alp2、Alp3、Epilons和ALP4蛋白，由等位基因編碼，同一個(gè)菌株只能表達(dá)α相關(guān)蛋白家族中的1個(gè)蛋白[16]。無(wú)乳鏈球菌α相關(guān)蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)缺失可能因丟失保護(hù)性抗原幫助細(xì)菌逃避宿主免疫，研究表明為在特定生存環(huán)境改變時(shí)α相關(guān)蛋白的多個(gè)重復(fù)序列發(fā)生自身變異，其中具有較長(zhǎng)的α相關(guān)蛋白的菌株對(duì)人的致病性提高，說(shuō)明α相關(guān)蛋白家族是與致病性相關(guān)的表面蛋白。本研究中發(fā)現(xiàn)3株細(xì)菌僅SAG-FX17號(hào)分離株為Alp1型，其他2株為未定型，說(shuō)明可能有新的無(wú)乳鏈球菌菌株出現(xiàn)。

細(xì)菌增殖過(guò)程包括遲緩期、對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期，影響細(xì)菌的毒性和致病力。該研究發(fā)現(xiàn)，臨床型乳腺炎奶牛乳汁和隱性乳腺炎奶牛乳汁的無(wú)乳鏈球菌分離株的體外培養(yǎng)增殖過(guò)程沒(méi)有明顯區(qū)別，說(shuō)明細(xì)菌增殖不是影響3株細(xì)菌感染能力差異的主要原因。生物被膜是細(xì)菌黏附在基質(zhì)表面，分泌多糖、纖維蛋白、核酸、脂質(zhì)等，將自身包裹在其中形成大量細(xì)菌聚集膜樣結(jié)構(gòu)[19]。免疫細(xì)胞所識(shí)別的細(xì)胞表面分子被生物被膜包裹，故不易被中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等清除。細(xì)菌從游離態(tài)變?yōu)樯锉荒B(tài)的過(guò)程中能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡甚至引起組織壞死[20]。生物被膜可以作為細(xì)菌“菌巢”，在感染過(guò)程中隨時(shí)釋放游離態(tài)細(xì)菌，是造成乳腺炎慢性炎癥和復(fù)發(fā)性感染的重要原因。無(wú)乳鏈球菌強(qiáng)毒株在體外培養(yǎng)中形成生物被膜，但本研究發(fā)現(xiàn)3株細(xì)菌在體外培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)均不能形成生物被膜，但臨床型乳腺炎分離株SAG-FX17在體外與奶牛乳腺上皮細(xì)胞Mac-T共孵育時(shí)形成生物被膜的能力明顯增強(qiáng)，說(shuō)明無(wú)乳鏈球菌在奶牛乳腺上皮細(xì)胞表面形成生物被膜可能增強(qiáng)細(xì)菌的感染能力。本研究還通過(guò)體外試驗(yàn)研究3株無(wú)乳鏈球菌對(duì)Mac-T的黏附侵襲及在細(xì)胞內(nèi)的存活能力，發(fā)現(xiàn)臨床型乳腺炎分離株SAG-FX17黏附能力明顯高于其他2株菌，該結(jié)果與生物被膜結(jié)果一致，細(xì)菌生物被膜的形成可能促進(jìn)細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附能力，細(xì)菌在感染過(guò)程中形成生物被膜不僅能夠抵御抗生素、抗菌肽等殺菌物質(zhì)，還可以增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)奶牛上皮細(xì)胞的黏附能力，從而有利于更多的細(xì)菌侵襲到細(xì)胞內(nèi)部[23]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌黏附上皮細(xì)胞后發(fā)生細(xì)菌內(nèi)化過(guò)程，細(xì)菌利用并激活宿主細(xì)胞信號(hào)通路引起細(xì)胞骨架重排進(jìn)入非吞噬細(xì)胞內(nèi)部[24]。乳房鏈球菌與停乳鏈球菌侵襲乳腺上皮細(xì)胞過(guò)程中發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格蛋白的內(nèi)化作用[25]。同時(shí)，細(xì)菌侵襲到細(xì)胞內(nèi)部與黏附細(xì)胞能力并不是正相關(guān)，致奶牛乳腺炎大腸桿菌侵襲乳腺上皮細(xì)胞能力較低，但沙門(mén)氏菌侵襲能力很強(qiáng)[26]。本研究中3株細(xì)菌侵襲到細(xì)菌內(nèi)部的能力很低，僅為黏附細(xì)菌數(shù)目的0.012%（SAG-FX17）、0.000 34%（CM31）、0.000 46%（CM41b），但黏附的細(xì)菌越多，侵襲到細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)菌越多。因此細(xì)菌在奶牛乳腺上皮細(xì)胞表面形成生物被膜，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附侵襲能力可能是影響無(wú)乳鏈球菌致病性的重要因素。

雖然3株無(wú)乳鏈球菌不易侵襲到細(xì)胞內(nèi)部，但侵襲到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌均具有一定存活的能力。其中，隱性乳腺炎分離株CM31在胞內(nèi)存活能力最弱，分離株CM41b在胞內(nèi)存活能力最強(qiáng)，侵入細(xì)胞2 h后54%的細(xì)菌存活，3、4 h增長(zhǎng)為88.4%、867%，說(shuō)明該細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)具有一定增殖能力，這可能是被該菌感染奶牛由隱性發(fā)展為臨床型乳腺炎的原因之一。LDH研究結(jié)果顯示，細(xì)菌與細(xì)胞互作的 6 h 內(nèi)，細(xì)胞保持較好的活性，因此本試驗(yàn)中只研究黏附后4 h內(nèi)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的存活能力。細(xì)菌能否長(zhǎng)時(shí)間在上皮細(xì)胞中存活或通過(guò)上皮細(xì)胞進(jìn)入到乳腺組織內(nèi)部還需要進(jìn)一步研究。細(xì)菌侵襲到細(xì)胞內(nèi)部并且在其中存活具有重大意義，不僅與細(xì)菌致病性相關(guān)，還影響僅具有胞外活性的抗生素對(duì)細(xì)菌性乳腺炎的治療作用[27]。

綜上所述，具有代表性的3株無(wú)乳鏈球菌分別為臨床型乳腺炎奶牛乳汁分離株SAG-FX17、隱性乳腺炎奶牛乳汁分離株CM31和隱性轉(zhuǎn)臨床型乳腺炎奶牛乳汁分離株CM41b，其血清型均為Ⅰa型，具有2b型菌毛，CM31、CM41b未檢測(cè)到任何一種目標(biāo)α相關(guān)蛋白基因，說(shuō)明可能有新無(wú)乳鏈球菌菌株出現(xiàn)。分離株SAG-FX17可以在奶牛乳腺上皮細(xì)胞上形成生物被膜，增強(qiáng)了細(xì)菌黏附乳腺上皮細(xì)胞的能力，增強(qiáng)該菌致病性和對(duì)殺菌物質(zhì)的抗性，可能是該分離株導(dǎo)致奶牛臨床型乳腺炎的主要原因。分離株CM41b在細(xì)胞內(nèi)具有較高的存活能力，可能是該菌感染奶牛由隱性發(fā)展為臨床型乳腺炎的重要原因。因此，形成生物被膜和侵襲到細(xì)胞內(nèi)部并存活對(duì)細(xì)菌性乳腺炎發(fā)展具有重要意義。本研究為進(jìn)一步揭示無(wú)乳鏈球菌致奶牛乳腺炎的致病機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為該病的預(yù)防和治療提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]Gomes F，Henriques M. Control of bovine mastitis：old and recent therapeutic approaches. Current Microbiology，2016，72（4）：377-382.

[2]Hogeveen H，Steeneveld W，Wolf C A. Production diseases reduce the efficiency of dairy production：a review of the results，methods，and approaches regarding the economics of mastitis. Annual Review of Resource Economics，2019，11：289-312.

[3]侯瑞強(qiáng).奶牛隱性乳腺炎及其防治. 當(dāng)代畜牧，2018（20）：36-37.

[4]Lakew B T，F(xiàn)ayera T，Ali Y M. Risk factors for bovine mastitis with the isolation and identification of Streptococcus agalactiaefrom farms in and around Haramaya district，eastern Ethiopia. Tropical Animal Health and Production，2019，51（6）：1507-1513.

[5]Aitken S L，Corl C M，Sordillo L M. Immunopathology of mastitis：insights into disease recognition and resolution. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia，2011，16（4）：291-304.

[6]駱 巧，呂 倩，羅正中，等. 奶牛場(chǎng)無(wú)乳鏈球菌傳播途徑新發(fā)現(xiàn). 中國(guó)奶牛，2020（4）：22-24.

[7]Shabayek S，Spellerberg B. Group B streptococcal colonization，molecular characteristics，and epidemiology. Frontiers in Microbiology，2018，9：437.

[8]Pietrocola G，Arciola C R，Rindi S，et al. Streptococcus agalactiae non-pilus，cell wall-anchored proteins：involvement in colonization and pathogenesis and potential as vaccine candidates. Frontiers in Immunology，2018，9：602.

[9]周明旭，左曉昕，徐 悅，等. 江蘇某牛場(chǎng)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定、耐藥性及保守抗原分析. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2019，40（6）：54-60.

[10]Reyes J，Chaffer M，Sanchez J，et al. Evaluation of the efficacy of intramuscular versus intramammary treatment of subclinical Streptococcus agalactiaemastitis in dairy cows in Colombia. Journal of Dairy Science，2015，98（8）：5294-5303.

[11]Imperi M，Pataracchia M，Alfarone G，et al. A multiplex PCR assay for the direct identification of the capsular type （Ⅰa to ⅠX） of Streptococcus agalactiae. Journal of Microbiological Methods，2010，80（2）：212-214.

[12]曾淑娟，趙文利，王 輝，等. 新生兒敗血癥無(wú)乳鏈球菌分型的研究. 中國(guó)婦幼保健，2015，30（34）：6028-6030.

[13]Lauer P，Rinaudo C D，Soriani M，et al. Genome analysis reveals pili in Group B Streptococcus. Science，2005，309（5731）：105.

[14]Moliveira I M，de Mattos M C，Pinto T A，et al. Genetic relatedness between group B streptococci originating from bovine mastitis and a human group B streptococcus type V cluster displaying an identical pulsed-field gel electrophoresis pattern. Clinical Microbiology and Infection，2006，12（9）：887-893.

[15]Kerro-Dego O，Prysliak T，Perez-Casal J，et al. Role of GapC in the pathogenesis of Staphylococcus aureus. Veterinary Microbiology，2012，156（3/4）：443-447.

[16]Radtke A，Bruheim T，Afset J E，et al. Multiple-locus variant-repeat assay （MLVA） is a useful tool for molecular epidemiologic analysis of Streptococcus agalactiaestrains causing bovine mastitis. Veterinary Microbiology，2012，157（3/4）：398-404.

[17]Shabayek S，Abdalla S，Abouzeid A M. Serotype and surface protein gene distribution of colonizing group B Streptococcusin women in Egypt. Epidemiology and Infection，2014，142（1）：208-210.

[18]Kong F，Gowan S，Martin D，et al. Molecular profiles of group B streptococcal surface protein antigen genes：relationship to molecular serotypes. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（2）：620-626.

[19]Silvestre I，Borrego M J，Jordo L. Biofilm formation by ST17 and ST19 strains of Streptococcus agalactiae. Research in Microbiology，2020，171（8）：311-318.

[20]Watters C，F(xiàn)leming D，Bishop D，et al. Host responses to biofilm. Progress in Molecular Biology and Translational Science，2016，142：193-239.

[21]Melchior M B，Vaarkamp H，F(xiàn)ink-Gremmels J. Biofilms：a role in recurrent mastitis infections？. Veterinary Journal，2006，171（3）：398-407.

[22]Fan H J. Advances in pathogenesis of Streptococcus suisserotype 2. Journal of Integrative Agriculture，2017，16（12）：2834-2847.

[23]Ma F，Yi L，Yu N，et al. Streptococcus suisserotype 2 biofilms inhibit the formation of neutrophil extracellular traps. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2017，7：86.

[24]Calvinho L F，Oliver S P. Characterization of mechanisms involved in uptake of Streptococcus dysgalactiaeby bovine mammary epithelial cells. Veterinary Microbiology，1998，63（2/3/4）：261-274.

[25]Almeida R A，Matthews K R，Cifrian E，et al. Staphylococcus aureusinvasive of bovine mammary epithelial cells. Journal of Dairy Science，1996，79：1021-1026.

[26]Dpfer D，Almeida R A，Lam T J，et al. Adhesion and invasion of Escherichia colifrom single and recurrent clinical cases of bovine mastitis in vitro. Veterinary Microbiology，2000，74（4）：331-343.

[27]Kamaruzzaman N F，Chong S，Edmondson-Brown K M，et al. Bactericidal and anti-biofilm effects of polyhexamethylene biguanide in models of intracellular and biofilm of Staphylococcus aureusisolated from bovine mastitis. Frontiers in Microbiology，2017，8：1518.