雙酶水解魚(yú)鱗蛋白制備ACE抑制肽的工藝優(yōu)化研究

苑園園 劉 暢 王燚欣 宋曉鑫

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 053000）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(An-giotensin I-converting enzyme，ACE)是導(dǎo)致高血壓的主要因素之一[1]。ACE是人體組織和體液中發(fā)現(xiàn)的一種含鋅的二肽羧基肽酶，能夠?qū)ρ獕浩鸬揭欢ǖ恼{(diào)控作用，血管緊張素Ⅰ可以在人體內(nèi)經(jīng)過(guò)ACE的催化作用轉(zhuǎn)化為可以使血管收縮并使血壓升高的血管緊張素Ⅱ[2]。

我國(guó)水資源豐富，在魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品生產(chǎn)加工過(guò)程中產(chǎn)生了很多下腳料，其中15%左右都是魚(yú)鱗[3]，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年廢棄的魚(yú)鱗達(dá)30萬(wàn)t，魚(yú)鱗中蛋白質(zhì)的含量高達(dá)50%~70%[4，5]，是非常好的生物資源。

目前制備ACE抑制肽多為單一蛋白酶水解，很少模擬胃腸道系統(tǒng)的酶解過(guò)程，而經(jīng)其他酶水解得到的ACE抑制肽在人體消化吸收過(guò)程中，由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用，其氨基酸序列有可能會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致ACE抑制能力的變化[6]。因此本試驗(yàn)選取的雙酶模擬胃腸道消化系統(tǒng)對(duì)魚(yú)鱗的酶解作用，可能將制備出更高活性的ACE抑制肽[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料。新鮮豬肺：衡水市萬(wàn)德福超市；新鮮鯉魚(yú)魚(yú)鱗：衡水市桃城區(qū)人民橋水產(chǎn)開(kāi)發(fā)市場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑。鹽酸(36.0%~38.0%)：煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；四硼酸鈉：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠(chǎng)；乙酸乙酯(AR)：天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；硼酸(AR)：天津市紅巖化學(xué)試劑廠(chǎng)；胰蛋白酶：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；胃蛋白酶：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸：上海麥克林生化科技有限公司；甘氨酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備。ST3100型pH計(jì)：奧豪斯儀器(常州)有限公司；BGZ-30型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；DS-1型高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠(chǎng)；Alpha 1-4/2-4 LD Plus德國(guó)Christ真空冷凍干燥機(jī)：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司廣州分公司；A11型研磨機(jī)：艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；UV-5500型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；TGL-16M型離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ACE粗酶的制備。新鮮的豬肺冷藏10 h左右，將黏膜、脂肪和氣管切除，將切好的豬肺放入高速組織搗碎機(jī)中，之后間歇性勻漿5min，保證比例，每5g的豬肺加入6 ml的硼酸緩沖溶液(pH值8.3，0.1 mol/L)，4℃，8 000 r/min離心15 min，收集上清液冷凍干燥備用[8]。

1.3.2 脫鈣魚(yú)鱗粉的制備。收集新鮮的鯉魚(yú)魚(yú)鱗，用清水洗凈，去除非魚(yú)鱗物質(zhì)，洗凈后50℃烘干2 h；將烘干后的魚(yú)鱗用10%(w/v)NaCl溶液5℃浸泡24 h，換液1次[9]，50℃烘干2 h；干燥后的魚(yú)鱗用0.4 mol/L的HCl溶液以料液比為1∶15(w/v)浸泡90 min進(jìn)行脫鈣[10]，用清水洗凈后再次放入烘箱50℃烘干2 h，放入研磨機(jī)打碎得到魚(yú)鱗粉冷藏備用。

1.3.3 魚(yú)鱗酶解物的制備。取適量脫鈣魚(yú)鱗粉溶于酶的緩沖液中，調(diào)節(jié)整體的pH值在酶的最適范圍內(nèi)，加酶進(jìn)行酶解，當(dāng)酶解反應(yīng)完成后應(yīng)立即沸水浴15 min，保證酶徹底失活，待整個(gè)反應(yīng)體系冷卻后離心15 min(10℃，4 000 r/min)，取上清液[11]。

1.3.4 ACE抑制率測(cè)定。本次試驗(yàn)采用紫外分光光度法[12]測(cè)定ACE抑制率，取酶解物上清液作為ACE抑制肽，將馬尿酰組氨酰亮氨酸(hippuryl-histidyl-leucine，HHL)溶于0.1 mol/L(pH值8.3，含Na-Cl)的硼酸鹽緩沖液配成濃度為12.5 mmol/L的底物，先取50μL底物于1.5 ml離心管中，再加入20μLACE抑制肽，兩者混勻后放入水浴鍋37℃保持5 min，接著再取40μLACE溶液于離心管中，放入水浴鍋37℃保持30 min，最后加入200μLHCl(1 mol/L)終止整個(gè)反應(yīng)，離心管中加入1 ml預(yù)冷過(guò)的乙酸乙酯，混合后放入離心機(jī)4 000 r/min離心15 min，吸取上層澄清液體750νL到試管中，烘箱內(nèi)120℃烘干15 min，使溶劑全部揮發(fā)，冷卻后向試管中加入3 ml的蒸餾水以溶解試管中的馬尿酸，混勻1 min后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為228 nm下測(cè)定溶液的吸光值，計(jì)算公式：ACE抑制率(%)=×100%；式中：A為加入ACE抑制劑的吸光度；B為ACE與HHL反應(yīng)的吸光度；C為空白反應(yīng)的吸光度。

1.4 胃蛋白酶提取條件的單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化1.4.1單因素試驗(yàn)。稱(chēng)取5份脫鈣后的魚(yú)鱗粉，料液比分別為1∶10(g/ml)、1∶15(g/ml)、1∶20(g/ml)、1∶25(g/ml)、1∶30(g/ml)，利用胃蛋白酶緩沖液調(diào)節(jié)pH值為2.0，溫度控制在37℃，分別調(diào)節(jié)胃蛋白酶的添加量在2%、4%、6%、8%、10%的條件下，酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，以ACE抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察酶解時(shí)料液比、胃蛋白酶的添加量、酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)鱗ACE抑制率的影響。

1.4.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(34)的正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 胃蛋白酶酶解脫鈣魚(yú)鱗粉正交試驗(yàn)因素水平表

1.4.3 胰蛋白酶提取條件的單因素試驗(yàn)優(yōu)化。利用胰蛋白酶緩沖液將胃蛋白酶酶解液pH值調(diào)節(jié)為8.0，溫度控制在40℃，分別調(diào)節(jié)胰蛋白酶的添加量在2%、4%、6%、8%、10%的條件下，酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，以ACE抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察酶解時(shí)料液比、胰蛋白酶的添加量、酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)鱗ACE抑制率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃蛋白酶酶解的單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 酶的添加量對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。如圖1，當(dāng)胃蛋白酶添加量增高，ACE抑制率升高，酶的添加量達(dá)到6%時(shí)，ACE抑制率最高，酶的添加量繼續(xù)增加，抑制率反而降低。當(dāng)酶過(guò)少時(shí)，酶與底物結(jié)合的幾率很小，抑制率較低，加酶量到達(dá)一定程度時(shí)，酶與反應(yīng)體系中的底物全部結(jié)合，抑制率達(dá)到最大值，但加酶量過(guò)多時(shí)就會(huì)影響底物與之結(jié)合，從而導(dǎo)致抑制率降低。因此，酶的添加量為6%時(shí)，魚(yú)鱗蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高，為57.6%。

圖1 不同胃蛋白酶的添加量下酶解產(chǎn)物的抑制率

2.1.2 料液比對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。如圖2，料液比增大的同時(shí)ACE抑制率也增大，當(dāng)增加到1∶40時(shí)達(dá)到最大，隨后抑制率降低。當(dāng)料液比高時(shí)，酶解體系比較濃稠，ACE抑制率降低[13]。因此，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，魚(yú)鱗蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高，為67.18%。

圖2 不同料液比下酶解產(chǎn)物的抑制率

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。如圖3，酶解開(kāi)始時(shí)，ACE抑制肽逐漸釋放其活性，ACE抑制率隨酶解時(shí)間的增加而升高，酶解時(shí)間為2 h時(shí)ACE抑制率最高，時(shí)間持續(xù)過(guò)長(zhǎng)則會(huì)適得其反，ACE抑制肽會(huì)被酶解喪失活性，ACE抑制率降低[14，15]。因此，當(dāng)水解時(shí)間為2 h時(shí)，魚(yú)鱗蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高，為79.7%。

圖3 不同酶解時(shí)間下酶解產(chǎn)物的抑制率

2.2 胃蛋白酶酶解魚(yú)鱗蛋白正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。由表2可知，料液比、酶的添加量、酶解時(shí)間這3個(gè)因素對(duì)ACE抑制率都會(huì)產(chǎn)生影響，在9個(gè)試驗(yàn)結(jié)果中，以試驗(yàn)2、試驗(yàn)8、試驗(yàn)9的結(jié)果最好，ACE抑制率基本達(dá)到70%以上，最佳方案為A1B3C2，即料液比1∶50，酶的添加量4%，酶解時(shí)間2 h，該組合并未出現(xiàn)在正交表中，所以進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下，經(jīng)3次平行試驗(yàn)后測(cè)得ACE抑制率為84.89%。通過(guò)比較R值可以看出，酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響最顯著。由表3的F值大小可看出，這3個(gè)因素的影響主次順序?yàn)椋篊＞B＞A。

表2 胃蛋白酶酶解脫鈣魚(yú)鱗粉正交試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)

表3 胃蛋白酶酶解脫鈣魚(yú)鱗粉正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.3 胰蛋白酶酶解的單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 酶的添加量對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。如圖4，酶的添加量較少時(shí)，酶與底物結(jié)合機(jī)會(huì)較少，形成的產(chǎn)物較少；ACE抑制率隨著加酶量的增加而升高，酶的添加量增加到一定程度而底物不變時(shí)，酶可以與底物完全結(jié)合，酶的添加量達(dá)到6%時(shí)，ACE抑制率最大；再增加胰蛋白酶的添加量時(shí)，可能會(huì)因?yàn)榉磻?yīng)體系已飽和而降低酶與底物的結(jié)合率導(dǎo)致ACE抑制率逐漸降低。因此，當(dāng)酶的添加量為6%時(shí)，魚(yú)鱗蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高，為92.13%。

圖4 不同酶的添加量下酶解產(chǎn)物的抑制率

2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。如圖5，當(dāng)酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)生的活性產(chǎn)物可能會(huì)被酶解，導(dǎo)致抑制率下降。當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí)魚(yú)鱗蛋白的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高，為93.37%。

圖5 不同酶解時(shí)間下酶解產(chǎn)物的抑制率

3 結(jié)論與討論

以脫鈣后的鯉魚(yú)魚(yú)鱗蛋白為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)證明，以胃蛋白酶酶解脫鈣魚(yú)鱗粉制備ACE抑制肽，當(dāng)酶的添加量8%、料液比1∶50(g/ml)、酶解時(shí)間2 h時(shí)，ACE抑制率為84.89%。以胰蛋白酶酶解脫鈣魚(yú)鱗粉制備ACE抑制肽，當(dāng)酶的添加量為6%、酶解時(shí)間為2 h時(shí)，ACE的抑制率為93.37%。結(jié)果表明先用胃蛋白酶酶解，再用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，最終得到的ACE抑制肽不會(huì)受人體胃腸道的影響。