紫蘇葉中α-淀粉酶抑制劑的提取工藝研究

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝疾病。近幾十年來，糖尿病患者的比例逐漸提高，90%以上的患者被診斷為2型糖尿病。糖尿病易引發(fā)各種并發(fā)癥，如神經(jīng)病變、腎病、肝損傷等[1]。因此，抑制或延緩糖尿病并發(fā)癥的有效途徑之一是通過抑制α-淀粉酶的活性來減緩葡萄糖的形成[2]。α-淀粉酶抑制劑（α-Amylase Inhibitor，α-AI）主要作用于人體的胃腸道，通過抑制α-淀粉酶的活性來延緩和阻礙碳水化合物的消化吸收，從而使血糖濃度降低[3]。目前，臨床上常用的降糖藥物有一定的治療效果，但易產(chǎn)生副作用。因此，研究者開始從植物中開發(fā)綠色安全、副作用小的α-淀粉酶抑制劑[4]。

紫蘇（Perilla frutescensL.）是一種藥食同源的中草藥，有近2000年的栽培歷史[5]。紫蘇全身是寶，其葉、莖和種子均可入藥，而葉子為最常用入藥器官。研究表明紫蘇具有抗氧化、治療心血管疾病、降血糖等活性，這些功能與其含有多種生物活性成分有關(guān)，如酚酸類、黃酮類、多糖類等[6-7]。因此，本研究以紫蘇葉為實驗原料，采用乙醇浸提的方法提取紫蘇葉中具有α-淀粉酶抑制活性的物質(zhì)，并通過正交實驗對其提取工藝條件進行優(yōu)化，為更好地開發(fā)利用紫蘇葉提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉購自于廣東省揭陽市；3,5-二硝基水楊酸；豬胰腺α-淀粉酶；可溶性淀粉；無水乙醇等。

1.2 儀器與設(shè)備

FLUOstar Omega多功能熒光酶標(biāo)儀，德國BMG LABTECH公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；H2050R高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫蘇葉預(yù)處理

先用自來水沖洗新鮮的紫蘇葉片表面，再用蒸餾水清洗，自然風(fēng)干，鼓風(fēng)干燥箱60 ℃烘10 h。多功能粉碎機粉碎后過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，裝自封袋中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 紫蘇葉α-淀粉酶抑制劑的提取工藝

準(zhǔn)確稱取3 g過篩后的粉末，加入一定體積的乙醇溶液，在恒定溫度下浸提一段時間。利用超聲波輔助提取30 min，10 000 r·min-1離心15 min，得到的上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用蒸餾水將不同實驗條件下獲得的紫蘇葉提取液定容至相同體積。

1.3.3 單因素實驗

采用上述提取方法，分別在不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25）、不同提取溫度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃）、不同乙醇濃度（10%、30%、50%、70%和90%）、不同提取時間（10 min、30 min、50 min、70 min和90 min）條件下進行浸提，探討上述因素對α-AI的抑制率的影響。

1.3.4 正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取料液比、提取溫度、乙醇濃度和提取時間這4個因素為自變量，α-AI的抑制率為因變量，采用L9(34)正交實驗法，確定α-AI的最優(yōu)提取條件。

1.3.5 α-AI活性測定

參考趙蓉等[8]的方法測定紫蘇葉提取物中α-AI的活性。將0.25 mL的紫蘇葉提取樣液與0.25 mL豬胰腺α-淀粉酶稀釋液（1.5 U·mL-1）混合，加入0.5 mL PBS溶液，37 ℃水浴10 min。加入0.5 mL 0.1%可溶性淀粉，37 ℃水浴反應(yīng)5 min。加入DNS試劑1 mL，沸水浴10 min，冷卻至室溫，540 nm處測定吸光值。α-AI的抑制率為

式中：A1、A2、A3和A4分別為空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比對α-AI的抑制率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增大，提取液中α-AI的抑制率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL）時α-AI的抑制率最好。說明適當(dāng)增加提取劑的用量，可以增大提取劑與α-AI的抑制率成分的接觸面積，有利于提取物中α-AI的抑制率成分的擴散，便于α-AI的抑制率成分的溶出，從而提高其抑制率[9]。繼續(xù)提高料液比，α-AI的抑制率反而下降。因為增加了提取液的體積，α-AI在體系中的濃度逐漸降低，從而導(dǎo)致其抑制率下降。因此最佳料液比為1∶20（g∶mL）。

圖1 料液比對α-AI的抑制率的影響圖

2.1.2 提取溫度對α-AI抑制率的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高，提取液中α-AI的抑制率逐漸增大，溫度達到60 ℃時，α-AI的抑制率最好。此后隨溫度的增加抑制率反而下降。因為溫度對α-AI的溶解度會產(chǎn)生一定影響，升溫會使分子熱運動逐漸加快，同時也會提高提取劑的擴散速度，加大提取劑對α-AI的溶解度[10]，利于提取物中降血糖的活性物質(zhì)得到釋放。但過高的溫度可能會導(dǎo)致α-淀粉酶抑制劑的穩(wěn)定性受到影響，同時α-AI成分也會部分失活，從而變性析出，降低其活性[9]。因此最佳提取溫度為60 ℃。

圖2 提取溫度對α-AI的抑制率的影響圖

2.1.3 乙醇濃度對α-AI抑制率的影響

由圖3可知，乙醇濃度在10%～70%，提取液中α-AI的抑制率隨著濃度的增加而升高，當(dāng)乙醇濃度為70%時α-AI的抑制率達到最大，提取效果最好，之后逐漸下降?？赡苁且驗橐掖紳舛鹊奶岣撸瑫龃筇崛毎臐B透作用[6]，有利于α-AI的抑制率成分從細胞中釋放出來，從而提高提取物中α-AI的抑制率。當(dāng)乙醇的濃度增加到一定程度后，物料中水的比例降低，會阻礙α-AI的溶出，從而影響其得率，α-AI的抑制率不升反降[10]。因此最佳乙醇濃度為70%。

圖3 乙醇濃度對α-AI的抑制率的影響圖

2.1.4 提取時間對α-AI抑制率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的延長，提取液中α-AI的抑制率逐漸提高，浸提時間為70 min時，α-AI的抑制率最好。說明在浸提初期，延長提取時間有利于α-AI的析出。當(dāng)活性成分在細胞內(nèi)外趨于平衡時，繼續(xù)增加浸提時間，提取液中能夠抑制α-AI活性成分的物質(zhì)濃度在增加，溶出物中α-AI活性成分所占的比例降低[11]。因此最佳提取時間為70 min。

圖4 提取時間對α-AI的抑制率的影響圖

2.2 正交實驗結(jié)果分析

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實驗法，因素與水平設(shè)計見表1。由表2可知，根據(jù)K值確定α-淀粉酶抑制劑提取的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D2，即料液比為1∶20（g∶mL），提取溫度為60 ℃，乙醇濃度為70%，提取時間為70 min。為進一步確定制備α-淀粉酶抑制劑的最佳工藝條件，對正交實驗的提取條件A2B2C2D2進行驗證。結(jié)果表明，α-淀粉酶抑制劑的抑制率平均值為59.12%。說明不同因素之間會存在一定的相互促進作用，優(yōu)化后α-AI的抑制率有所提高。

表1 正交實驗因素與水平表

表2 正交實驗結(jié)果表

續(xù)表2

3 結(jié)論

本實驗探討了料液比、提取溫度、乙醇濃度和提取時間對紫蘇葉提取物中α-AI的抑制率的影響，在單因素實驗基礎(chǔ)上，優(yōu)化了α-AI的提取條件。影響α-AI的抑制率的因素依次為料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間。α-淀粉酶抑制劑提取的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D2，即料液比為1∶20（g∶mL），提取溫度為60 ℃，乙醇濃度為70%，浸提時間為70 min，得到的α-淀粉酶抑制劑的抑制率為59.12%。